四川黑茶渥堆過程中主要品質成分和茶湯色差變化及其相關性研究

張廳，劉曉，熊元元，王小萍，黃藩，王云，李春華，唐曉波*，郭承義

1(四川省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，四川 成都，610066)2(四川省雅安義興藏茶有限公司，四川 雅安，625101)

黑茶是我國6大茶類之一，是加工過程中有微生物參與品質形成的后發(fā)酵茶，主要產(chǎn)于湖南、云南、四川等地。目前四川保留的傳統(tǒng)黑茶花色主要是康磚和金尖兩類邊銷藏茶，其在原料嫩度上有所區(qū)別。近年來，基于“藏茶漢飲”的市場需求，以及人們對黑茶健康作用的認識和消費需求，很多企業(yè)大量生產(chǎn)了用于滿足非藏族地區(qū)消費的新工藝黑茶，如邛崍黑茶。傳統(tǒng)四川黑茶工藝較繁瑣，最多的要經(jīng)過18道工序，經(jīng)過茶葉工作者的不斷改進，結合市場需求及茶葉加工技術的發(fā)展，其工藝已大為簡化，現(xiàn)階段一種主流做法是采用綠毛茶干坯渥堆，鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、干燥后制得綠毛茶，存放一段時間，再經(jīng)一次性渥堆發(fā)酵到位，再干燥制成黑毛茶。

黑茶初制加工中，有一道特殊的“渥堆”工序，在微生物及其他化學反應的共同參與下，茶葉中的黃酮類、多酚類、生物堿類等具有刺激性、收斂性的物質發(fā)生了深度的氧化、聚合、水解，造就了黑茶獨特的品質特征[1]。四川農(nóng)業(yè)大學研究人員對傳統(tǒng)四川黑茶渥堆過程中主要品質成分、酶類活性變化及感官品質進行了初步研究[2-6]。

茶葉色澤包括干茶色澤、湯色、葉底色澤3部分，是茶葉品質的重要組成部分。同時，茶葉色澤與茶葉品質存在著一定的關系，尤其是茶湯色澤與茶葉內含成分之間存在一定的相關性，黃酮醇及其苷類、兒茶素氧化產(chǎn)物被認為是影響綠茶茶湯的主要呈色物質[7]，因此茶湯色澤的測評在茶葉品質的評價中起著重要作用。用于色澤評定的現(xiàn)代儀器分析主要是色差分析，主要依靠均勻顏色空間表征食品色澤屬性。色差分析在紅茶加工及產(chǎn)品品質評價方面有較多應用，如分析不同紅茶品質[8]、評價紅茶湯色亮度[9]、監(jiān)測紅茶萎凋及發(fā)酵等[10-13]，此外色差分析還應用到綠茶、黃茶及烏龍茶的品質評價中[14-16]，但應用到黑茶渥堆過程中茶湯色差的評價中還鮮見報道。

本文對四川黑茶干坯渥堆95 d過程中主要品質成分變化進行了分析，探明其變化規(guī)律，同時采用色差分析方法，結合數(shù)理統(tǒng)計探討了渥堆過程中茶湯色澤變化及其與主要品質成分之間的相互關系，并建立了茶湯色差值與主要品質成分的多元線性回歸方程，以期為四川黑茶渥堆過程中品質形成機理的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

渥堆過程樣品，四川省雅安義興藏茶有限公司，取樣時間2019年6月14日～2019年9月18日。

乙腈、甲酸、甲醇(均為色譜純)、咖啡堿、兒茶素標準品包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素(epicatechin，EC)、兒茶素(catechin, C)及標準品楊梅素-3-半乳糖苷等，美國Sigma公司。其他試劑藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

QUINTIX224-1CN電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；HH-S電子恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；HPLC-20 AD高效液相色譜儀、UV-2550紫外-可見分光光度計，日本島津公司，PFX-i Series spectro Colormeter高精度自動分光色差儀，英國Lovibond公司。超高效液相色譜-質譜系統(tǒng)由Agilent 1290超高效液相色譜(美國Agilent公司)串聯(lián)Q Exactive Orbitrap高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)組成。所用色譜柱為UPLC HSS T3色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)，美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 四川黑茶加工工藝流程

鮮葉攤放→殺青→揉捻→炒干→陳放→渥堆→干燥。

渥堆堆高在1 m左右，當堆心溫度升至60 ℃以上時，進行翻堆，翻堆頻率約每周1次。

1.3.2 樣品采集

每翻堆1次取1次樣，采用5點取樣法，取距堆表50 cm處的茶樣，設3個重復，取樣后立即用冰盒保存樣品并帶回實驗室，供理化分析。取樣包括渥堆0、7、13、20、27、34、41、48、55、61、69、76、83、95 d，共14個茶樣。

1.3.3 主要生化成分測定

水浸出物、茶多酚、兒茶素總量、游離氨基酸含量測定參照國標GB/T 8305—2013、GB/T 8313—2018、GB/T 8314—2013；兒茶素組分、咖啡堿的測定采用HPLC方法[17]；茶黃素、茶紅素、茶褐素含量測定采用系統(tǒng)分析法[18]；茶多糖總量測定參照蒽酮-硫酸法[19]。黃酮醇糖苷類化合物的測定參照王智聰?shù)萚20]及戴偉東等[21]方法進行，采用相對定量。

1.3.4 感官審評方法

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》。

1.3.5 茶湯色差值測定

取3 g茶樣，加沸蒸餾水150 mL沖泡5 min，趁熱用濾紙過濾，濾液冷卻至室溫，用分光色差儀測定，3次重復。采用L、a、b色差系統(tǒng)進行測定，其中L值代表明度；a代表紅綠色度，“+”代表紅色程度，“-”代表綠色程度；b代表黃藍色度，“+”代表黃色程度，“-”代表藍色程度[9]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用DPS 9.50軟件進行方差及顯著性分析、相關性分析、逐步回歸與通徑分析。采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 四川黑茶渥堆過程中主要品質成分含量的變化

2.1.1 水浸出物含量變化

水浸出物是一切水可溶性物質的總和，對茶葉品質起決定性的作用。圖1可以看出，在渥堆早期(0～7 d)，水浸出物含量顯著增加，從40.83%增加到50.86%，增幅達24.57%，隨后逐漸下降到第34天的47.27%，在渥堆中后期(34～61 d)水浸出物含量為46.7%～48.33%，隨后顯著降低至渥堆結束時的42.57%。整個渥堆過程水浸出物含量增加了4.26%。

圖1 四川黑茶渥堆過程中水浸出物含量變化Fig.1 Content of water extracts of Sichuan dark tea during post-fermentation 注：柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

在渥堆早期，微生物大量繁殖并通過分泌纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等以及濕熱作用使水不溶性的纖維素、果膠、蛋白質等大分子物質降解為可溶性化合物，從而使水浸出物含量上升；但隨著渥堆的進行，微生物繼續(xù)大量繁殖，將分解的可溶性化合物作為碳源、氮源進行消耗，使水浸出物含量降低[4-5]。

2.1.2 游離氨基酸含量變化

氨基酸既是茶葉的呈味物質，又是茶葉香氣的重要基質，對黑茶品質形成起著重要作用。由圖2可知，在整個渥堆過程中，游離氨基酸含量呈下降趨勢，但在某個時間段又保持相對穩(wěn)定，直至渥堆結束，游離氨基酸含量下降了78.80%。

圖2 四川黑茶渥堆過程中游離氨基酸含量變化Fig.2 Contents of free amino acids of Sichuan dark tea during post-fermentation

在渥堆過程中，大量繁殖的微生物分泌胞外酶，將蛋白質水解，但整個過程中游離氨基酸并未得到積累，可能是因為微生物將氨基酸作為其生長所需氮源而利用消耗掉，同時，氨基酸與可溶性糖還可產(chǎn)生美拉德反應[3]。

2.1.3 咖啡堿含量變化

咖啡堿是茶葉中主要的嘌呤堿，是構成茶湯的重要滋味物質。圖3可以看出，咖啡堿含量在渥堆前期(0～13 d)呈顯著增加趨勢，由2.91%增加到3.43%，增加了17.87%。在渥堆的第13～48天，其含量穩(wěn)定在3.41%～3.47%，隨后逐漸增加至渥堆結束時的3.60%。整個渥堆過程中，咖啡堿含量增加了23.71%。

圖3 四川黑茶渥堆過程中咖啡堿含量變化Fig.3 Contents of caffeine of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.1.4 茶多糖含量變化

茶多糖是茶葉中存在的一類具有多種生物活性的多糖復合物，大多為與蛋白質結合的酸性糖蛋白[22]。目前已有研究表明茶多糖具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)腸道微生態(tài)等多種生物功效[23-25]。圖4可以看出，茶多糖含量在整個渥堆過程中呈波動上升趨勢，直至渥堆結束，茶多糖含量顯著增加3.51倍。茶多糖被認為是黑茶中重要的功能性成分之一，其含量在渥堆過程中大幅增加，是黑茶品質形成的重要保證。

圖4 四川黑茶渥堆過程中茶多糖含量變化Fig.4 Contents of tea polysaccharide of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2 四川黑茶渥堆過程中多酚類物質及其轉化產(chǎn)物含量的變化

2.2.1 茶多酚含量變化

茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱。由圖5可以看出，在渥堆前期(0～27 d)，茶多酚含量穩(wěn)定在14.15%～14.53%，隨后逐漸下降至渥堆第41天的12.61%，在渥堆第41～61天，茶多酚含量穩(wěn)定在12.40%～12.82%，隨后又逐漸下降至渥堆結束時的9.60%。總體來說，整個渥堆過程，茶多酚含量呈下降趨勢，降幅達32.4%。

圖5 四川黑茶渥堆過程中茶多酚含量變化Fig.5 Contents of tea polyphenols of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2.2 兒茶素總量及組分含量的變化

結果表明(表1)，兒茶素總量及其組分在渥堆前55 d迅速下降，隨后至第61天有一個短暫的回升，最后又迅速下降至渥堆結束時的低值。此時，樣品中EGCG、EC、ECG、C含量已非常低甚至檢測不出。在整個渥堆過程中，兒茶素總量、EGC、EC、EGCG和ECG分別下降96.60%、83.33%、93.90%、98.68%和99.17%。

茶葉中的兒茶素是多酚類物質的主體，因此，茶多酚含量的減少主要體現(xiàn)在兒茶素類物質含量的降低，這與其他學者研究結果一致[2-4]。而茶多酚含量的降低則主要歸因于渥堆過程中茶多酚在微生物分泌的胞外酶及濕熱作用下發(fā)生酶促和非酶促氧化、聚合及轉化等系列反應[1]。

表1 四川黑茶渥堆過程中兒茶素總量及組分含量的變化 單位：%

2.2.3 茶色素含量變化

茶黃素、茶紅素、茶褐素是黑茶中多酚類物質的主要水溶性氧化產(chǎn)物，也是構成茶湯色澤及滋味的重要物質。圖6-a、圖6-b可以看出，茶黃素和茶紅素含量在整個渥堆過程中均不同程度下降，至渥堆結束，分別下降53.55%、37.50%。但茶黃素和茶紅素含量在渥堆過程中的某個時間段保持相對穩(wěn)定，說明其進一步轉化需要一定的過程及條件。茶褐素含量在渥堆的早期(至第7天)呈下降趨勢，隨后不斷增加，直至渥堆結束含量達5.54%，增幅達110.65%(圖6-c)。

在黑茶渥堆過程中，部分多酚類物質主要在多酚氧化酶的作用下氧化、聚合為茶黃素，茶黃素進而與雙黃烷醇偶聯(lián)氧化形成茶紅素，最終促使茶褐素的形成[26]。

a-茶黃素；b-茶紅素；c-茶褐素圖6 四川黑茶渥堆過程中茶色素含量變化Fig.6 Changes of tea pigments contents of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2.4 黃酮醇苷類物質含量的變化

茶葉中含有豐富的黃酮苷類物質，以黃酮醇苷為主，主要為槲皮素苷、楊梅素苷及山奈酚苷，其水溶液為綠黃色，被認為是綠茶湯色的重要組分[26]。如表2所示，在黑茶渥堆過程中主要檢測出了8種黃酮醇苷，含量較高的有山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷和楊梅素-3-半乳糖苷，除槲皮素-3-葡萄糖苷含量在渥堆結束后顯著增加，黃酮醇苷總量及其他7個組分含量在渥堆結束后顯著下降，且大多數(shù)黃酮醇苷在渥堆過程中呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

表2 四川黑茶渥堆過程中黃酮醇苷類物質含量的變化 單位：mg/kg

2.3 四川黑茶渥堆過程中茶湯色澤的變化

表3可知，渥堆不同階段茶湯色差值差異顯著，隨著渥堆的進行，L值逐漸降低，茶湯明度降低；a值由負向正逐漸升高，湯色由“綠”向“紅”過度；b值波動升高，湯色黃色程度加深。感官審評顯示，湯色由黃綠→綠黃→黃→橙黃→橙紅→棕紅→棕褐轉變，明亮度也逐漸降低，感官審評與色差值契合較好。

表3 四川黑茶渥堆過程中茶湯色澤的變化Table 3 Changes of tea soup color of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.4 四川黑茶渥堆過程中茶湯色差值與主要品質成分含量相關性分析

由表4可知，黑茶茶湯L值與氨基酸、茶多酚、茶黃素、茶紅素、兒茶素、楊梅素-3-半乳糖苷、楊梅素-3-新橘皮糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、山奈酚-3-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-(6″-沒食子酰)葡萄糖苷、山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷含量及黃酮醇苷總量呈極顯著正相關，與咖啡堿、茶多糖、茶褐素及槲皮素-3-葡萄糖苷含量呈極顯著負相關；而a值、b值與各成分含量的相關性則表現(xiàn)出與L值相反的結果。

2.5 主要品質成分對茶湯L、a、b值的逐步回歸與通徑分析

為了進一步分析四川黑茶渥堆過程中主要品質成分及色素含量對茶湯色差值影響，并找出影響茶湯色差值的主要因素，以L、a、b值為應變量，氨基酸含量X1(%)、茶多酚含量X2(%)、咖啡堿含量X3(%)、茶多糖含量X4(%)、茶黃素含量X5(%)、茶紅素含量X6(%)、茶褐素含量X7(%)、兒茶素總量X8(%)、黃酮醇苷總量X9(mg/kg)為自變量進行逐步回歸與通徑分析，并建立了L、a、b值的多元線性回歸方程。結果見表5～表7。

表4 L、a、b值與主要品質成分含量相關性分析Table 4 Correlation analysis of L, a, b value and content of main quality components

由表5可知，當考慮各內含成分之間的相互作用與交互關系時，茶黃素含量、茶紅素含量、黃酮醇苷總量的增加可直接促進L值的增加；而氨基酸、茶褐素含量對L值的直接抑制作用較大，這些成分是直接影響L值的主要因素。此外氨基酸、茶黃素含量及黃酮醇苷總量通過影響茶紅素及茶褐素含量進而對L值產(chǎn)生的間接影響作用也較顯著。

表5 主要品質成分對茶湯L值的逐步回歸與通徑分析Table 5 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the L value of tea soup

由表6可知，黃酮醇苷總量對a值的直接通徑系數(shù)達到了-0.60，是抑制a值的最主要因素，此外，茶黃素含量對a值的直接抑制作用也較為顯著，而茶褐素含量對L值的直接促進作用最為顯著。因此，黃酮醇苷總量、茶黃素含量、茶褐素含量是直接影響a值的主要因素。此外，氨基酸、咖啡堿、茶黃素、茶褐素含量及兒茶素總量通過影響黃酮醇苷總量進而對a值產(chǎn)生的間接影響也不可忽視。

表6 主要品質成分對茶湯a值的逐步回歸與通徑分析Table 6 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the a value of tea soup

表7顯示，茶多糖含量、兒茶素及黃酮醇苷總量對b值的直接抑制作用較大，而茶褐素含量對b值的直接促進作用最為顯著，這些成分是直接影響b值的主要因素。此外，一些物質通過影響茶多糖含量、兒茶素總量及黃酮醇苷總量進而對b值產(chǎn)生間接影響作用也不可忽視。

表7 主要品質成分對茶湯b值的逐步回歸與通徑分析Table 7 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the b value of tea soup

3 討論與結論

渥堆是四川黑茶品質形成的關鍵工序，在此進程中，茶葉中內含物質發(fā)生復雜的化學變化，形成四川黑茶滋味陳醇、湯色紅濃明亮的品質特征。渥堆有濕坯渥堆和干坯渥堆2種方式。渥堆方式、渥堆條件、毛茶原料嫩度及水分含量、渥堆過程中加水量以及人們對渥堆在制品品質的把控差異等決定了渥堆時間的長短，渥堆時間從十幾小時至幾十天不等。渥堆時間長短不同，樣品的各種內含成分就會有所差異。例如，劉婷婷等[3]研究了傳統(tǒng)四川黑茶在渥堆24 d過程中主要品質成分的變化，發(fā)現(xiàn)除咖啡堿含量變化不明顯外，茶多酚、兒茶素、茶黃素、茶紅素、茶褐素、游離氨基酸等均下降。鄒瑤等[6]研究表明：一翻后，四川黑茶品質成分的轉化已基本完成。而陳應娟等[4]發(fā)現(xiàn)游離氨基酸、茶多酚、兒茶素等的含量在加工過程中均減少，水浸出物、咖啡堿、茶黃素等的含量則增加。LI等[27]研究了下關沱茶渥堆56 d內相關內含成分的變化情況，發(fā)現(xiàn)茶多酚總量下降了54%，而咖啡堿含量上升了59%。茶氨酸和游離氨基酸含量分別降低了81.1%和92.85%。而LI等[28]發(fā)現(xiàn)水浸出物含量、茶多酚總量、總黃酮含量、游離氨基酸含量及可溶性糖含量在湖南黑毛茶渥堆12 h內均顯著降低。本課題研究了四川黑茶干坯渥堆95 d內主要生化成分的變化情況，一些成分變化表現(xiàn)出了差異性。例如，水浸出含量在渥堆的前7 d顯著增加，而后逐漸下降；咖啡堿含量在渥堆前13 d顯著增加，第13～48天保持相對穩(wěn)定，隨后又逐漸增加至渥堆結束；兒茶素總量及其組分含量在渥堆前55 d迅速下降，隨后至第61天有一個短暫的回升，最后又迅速下降至渥堆結束時的低值等。此外，還研究了四川黑茶渥堆過程中黃酮醇苷類物質含量的變化，發(fā)現(xiàn)除槲皮素-3-葡萄糖苷含量在渥堆結束后顯著增加，黃酮醇苷總量及其他7個組分含量在渥堆結束后顯著下降,且大多數(shù)黃酮醇苷在渥堆過程中呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，黃酮苷類物質含量的普遍下降跟渥堆過程中在熱和酶的作用下發(fā)生水解，并進一步氧化有關[26]。

四川黑茶渥堆過程中茶湯色澤變化非常明顯，感官審評表明湯色由黃綠→綠黃→黃→橙黃→橙紅→棕紅→棕褐轉變。研究表明，茶湯色澤與茶葉內多種內含成分存在極顯著的相關性。以往部分研究及經(jīng)驗表明，不管是干茶還是茶湯色澤應由茶葉中呈色相關物質決定。例如楊娟等[8]研究表明茶褐素含量越高，茶湯的亮度越低，但茶湯更紅。王璟等[15]研究表明黃茶的外觀色度值與總葉綠素含量及茶紅素含量有關。余書平等[13]研究表明紅茶發(fā)酵葉色差值的變化能夠較好地表征兒茶素組分、茶黃素組分、茶紅素、茶褐素的變化特性。朱博等[7]研究表明楊梅素苷類與貯藏期間的綠茶茶湯色澤的關系最密切。但通過逐步回歸與通徑分析，考慮到各內含成分之間的相互關系與交互作用時發(fā)現(xiàn)，茶紅素、茶褐素含量及黃酮醇苷總量等是直接影響四川黑茶茶湯L值的主要因素，茶黃素、茶褐素含量及黃酮醇苷總量是直接影響四川黑茶茶湯a值的主要因素，而茶多糖、茶褐素含量及兒茶素、黃酮醇苷總量是直接影響四川黑茶茶湯b值的主要因素。另外，一些物質還可以通過影響另一些物質的含量進而對茶湯色差值產(chǎn)生間接影響。本研究還建立了L、a、b值與主要內含成分之間的多元線性回歸方程，初步探明了四川黑茶渥堆過程中茶湯色差值與主要內含成分之間的關系。