乳酸菌食品中污染菌的計數和MALDI-TOF MS鑒定

凌莉，呂敬章，陳晶，江月，萬志剛，劉婧文，嚴瓊英，盧行安

1(廣州海關技術中心，廣東 廣州，510623)2(深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳，518045) 3(深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳，518045)4(深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳，518131) 5(廣東藥科大學，廣東 中山，528045)6(中國檢驗檢疫科學研究院，北京，100176)

乳酸菌是一類利用可發酵的碳水化合物產生大量乳酸的細菌，從分類學上看，乳酸菌至少包含了乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、芽胞桿菌屬等23個菌屬[1]。有關乳酸菌提高營養物質利用率、預防和治療疾病、調節機體的免疫力等益生功能已有很多報道[2]，最新的研究發現，乳酸菌還可通過“腦腸軸”對行為模式進行調節[3]。除了用于生產發酵乳，為改善產品風味等原因，乳酸菌也廣泛添加在飲料、奶粉、餅干、糖果等食品中[4-9]。

在食品安全國家標準中，對乳酸菌食品質量安全的關注點，主要集中在兩方面：一是乳酸菌的含量。由于乳酸菌必須達到一定的數量才能發揮益生作用，因此在GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》、GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》和GB 7101—2015《食品安全國家標準 飲料》中均規定，乳酸菌的含量不得小于106CFU/mL(g)。二是乳酸菌食品的污染菌，包括菌落總數、大腸菌群、霉菌酵母等指示菌，以及沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌。在含乳酸菌食品的國家標準中，對菌落總數的規定存在較大差異。因為產品中存在活的乳酸菌，進行菌落總數測定時，一些乳酸菌會在平板計數瓊脂上生長，而對菌落總數結果造成干擾，發酵乳和飲料的食品安全國家標準因此沒有設置菌落總數的限量。然而，有些標準如GB 10765—2010，基于菌落總數測定是在有氧條件下進行的，對添加了厭氧乳酸菌的產品，又規定了菌落總數的限量。這些標準的差異，對乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌的計數造成了較大的困擾。一方面，食品安全國家標準對食品中添加的菌株是否為厭氧菌的判斷，沒有具體規定；另一方面，為保持雙歧桿菌等厭氧菌的高活性并發揮益生功效，一些菌劑的生產廠商對雙歧桿菌進行了耐氧馴化[10]，使得一些傳統上認為是厭氧的乳酸菌，在有氧的條件下也能生長。因此，須從計數平板上排除乳酸菌的干擾，只是特異性針對非乳酸菌等污染菌進行計數。

對計數瓊脂上菌落的鑒定，以迅速準確區分乳酸菌與非乳酸菌，是乳酸菌食品中污染菌計數的又一難點。采用傳統的生物化學方法鑒定乳酸菌，操作繁瑣且準確性低[11]；近來興起的一些分子生物學方法檢測乳酸菌，如PCR法、16S rDNA/rRNA基因序列分析法、變性梯度凝膠電泳法等等，但都要采用特定的引物或探針，針對特定菌進行檢測，并不適合對未知菌的鑒定[12-15]，變性梯度凝膠電泳法等方法還要對PCR產物進行后處理[16]。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜是近年來發展起來的一種用于蛋白質、多肽等生物大分子鑒定的新技術，其原理是將待測菌與基質混合后，用激光轟擊電離，根據到達檢測器的時間及離子的數量，繪制橫軸為質荷比m/z、縱軸為峰強度值的圖譜，與數據庫中的圖譜進行比對后對微生物進行鑒定[17]，整個操作過程只需1 h便有檢測結果。該方法具有操作簡單、速度快、成本低、通量高的特點，而且鑒定前無需進行革蘭氏染色，還可用于芽胞菌、霉菌、酵母的快速鑒定，特別適用于未知菌的鑒定。

因此，本文參考ISO 13559:2002—Butter, fermented milks and fresh cheese—Enumeration of contaminating microorganisms-Colony-count technique at 30 ℃，使用不含糖的計數瓊脂 (count agar sugar free，CASF)，對含活乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌進行計數；同時按照食品安全國家標準GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法，分別對乳酸菌食品中的乳酸菌、菌落總數進行計數。并采用MALDI-TOF MS法對CASF和平板計數瓊脂(plate count agar，PCA)平板上的菌落進行鑒定，以迅速區分乳酸菌與非乳酸菌，探討適合乳酸菌食品中污染菌的計數方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

INE800型恒溫培養箱，德國MEMMERT公司；MARK Ⅱ厭氧培養系統，荷蘭ANOXOMAT公司；VITEK MS基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，法國生物梅里埃公司。

MRS瓊脂(批號190124)、PCA(批號201203)，北京陸橋技術股份有限公司；CASF(批號VM913678011)，MERCK公司；CHCA基質液(批號1008255570)，法國生物梅里埃公司；大腸埃希氏菌ATCC 8739，Microbiologics。

動物雙歧桿菌Bb-12菌粉、乳雙歧桿菌菌粉、保加利亞乳桿菌菌粉、德氏乳桿菌菌粉、嗜熱鏈球菌菌粉、長雙歧桿菌菌粉，呼和浩特市某乳酸菌粉廠；國產和進口含活乳酸菌的固體飲料10份、發酵乳2份，市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌、非乳酸菌、菌落總數計數

無菌取25 g樣品置于裝有225 mL無菌生理鹽水的均質袋中，均質2 min，選取2～3個合適的稀釋度，每個稀釋度各吸取0.1 mL樣品勻液涂布于CASF瓊脂表面，30 ℃需氧培養72 h；同時吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿中，傾注MRS瓊脂培養基， 36 ℃厭氧培養72 h；另外吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿中，傾注PCA培養基，36 ℃需氧培養48 h。每個稀釋度做2個平行，15 min內完成從樣品稀釋到平皿傾注。每個樣品重復3次實驗。

1.2.2 菌落鑒定

將待鑒定菌落劃線于血平板36 ℃培養24 h，或接種在MRS平板后36 ℃厭氧培養72 h，挑取培養物的單個菌落涂布至靶板孔，立即加入1 μL CHCA基質液；同時挑取質控菌株大腸埃希氏菌ATCC 8739純培養物涂布至質控孔，立即加入 1 μL CHCA基質液；干燥后，用VITEK MS進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌粉的計數結果及分析

由表1數據可見，6種乳酸菌菌粉在MRS平板上生長良好，乳酸菌計數結果與其標稱的數量一致。在有氧條件下培養的PCA和CASF平板上，未見菌落生長，表明這6種乳酸菌在PCA瓊脂上不生長，菌粉也沒有受到非乳酸菌的污染。

表1 乳酸菌粉的計數結果 單位：CFU/g

2.2 市售含乳酸菌食品的計數和鑒定結果及分析

從表2可知，市售的10種固體飲料和2種發酵乳的乳酸菌計數結果均大于106CFU/g，表明這些食品中乳酸菌含量符合相關標準GB 7101—2015和GB 19302—2010的要求。而這些乳酸菌食品的PCA和CASF的計數和菌落鑒定結果大致有以下5種情況。

表2 市售乳酸菌食品的計數及鑒定結果 單位：CFU/g

(1)PCA上既有較多細小的菌落，又有少量較大的菌落(圖1-a)，CASF上少量的菌落都比較大(圖1-b)，如樣品1。PCA上細小的菌落，MALDI-TOF MS鑒定為凝結芽胞桿菌，是樣品標稱添加的乳酸菌。PCA和CASF上較大的菌落，鑒定為蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌，屬于污染菌。

a-PCA; b-CASF圖1 固體飲料GS在不同培養基上的菌落Fig.1 Colonies of solid beverage GS on different agar plates

(2)PCA和CASF少量的菌落都比較大，如樣品2。PCA和CASF上較大的菌落，鑒定為地衣芽胞桿菌和克勞氏芽胞桿菌，屬于污染菌。

(3)PCA上有較多細小的菌落，CASF上少量的菌落都比較大，如樣品3和樣品4。PCA上細小的菌落，MALDI-TOF MS鑒定為干酪乳桿菌(圖2)，是樣品標稱添加的乳酸菌。CASF上較大的菌落，鑒定為蠟樣芽胞桿菌(圖3)，屬于污染菌。樣品11的菌落鑒定結果也是如此。

圖2 干酪乳桿菌的MALDI-TOF MS圖譜Fig.2 Mass spectrum of L. casei

圖3 蠟樣芽胞桿菌的MALDI-TOF MS圖譜Fig.3 Mass spectrum of B. cereus

(4)PCA和CASF上均未見菌落生長，如樣品5～樣品8。

(5)PCA上有較多細小的菌落， CASF上未見的菌落生長，如樣品9、10、12。PCA上細小的菌落，MALDI-TOF MS鑒定結果屬于乳酸菌。

對以上乳酸菌食品的計數和鑒定結果的分析發現，由于某些乳酸菌可在PCA上形成細小的菌落，因此不宜用菌落總數測定來計數乳酸菌食品中的污染菌。然而CASF上的菌落，經鑒定均不是樣品標稱添加的乳酸菌，而是蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌等污染菌，CASF可以用來計數乳酸菌食品中的污染菌。

3 結論與討論

由于乳酸菌的益生功能，乳酸菌現已被廣泛添加到許多食品中，含乳酸菌食品的質量安全也受到廣泛關注[18-19]。乳酸菌食品中污染菌的數量，也是指示乳酸菌食品加工過程衛生狀況的重要指標之一，但是乳酸菌食品中污染菌計數的難度較大，導致乳酸菌食品菌落總數限量的設置和結果判斷分歧較大。

乳酸菌食品中污染菌計數的難點之一，是缺乏特異性的計數瓊脂。近來有研究根據乳酸菌需要利用糖類以及適宜酸性生長環境的特性，采用pH為8.0且不含糖的計數瓊脂CASF，對乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌進行計數[20]。本文采用這一方法，對12種市售乳酸菌食品中污染菌計數發現，該瓊脂可排除樣品中乳酸菌的干擾，并特異性計數乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌。

本文采用PCA和CASF平板，對乳酸菌食品菌落總數的計數結果進行比對，并利用MALDI-TOF MS技術對未知菌的快速鑒定優勢，對PCA和CASF平板上的菌落進行快速準確鑒定，達到迅速區分乳酸菌與非乳酸菌的目的。本文發現，采用CASF計數，結合MALDI-TOF MS鑒定技術，可迅速準確地對乳酸菌食品中污染菌進行計數和鑒定。