固態發酵技術強化麩皮酚類物質釋放的研究進展

李光耀，柴新想，程偉，馮妍，張光智，張明霞，王寶石*

1(河南科技學院 生命科技學院，現代生物育種河南省協同創新中心，河南 新鄉,453003) 2(夏盛(北京)生物科技開發有限公司，北京,100101)

麩皮為谷物加工副產物，一般用作動物飼料或釀酒原料而附加值較低，或作為農業廢棄物直接丟棄而危害環境，如何實現麩皮高值化利用是亟待解決的重要課題。近年來，一些研究發現谷物中酚類物質具有重要的功能特性，在預防癌癥、肥胖癥、糖尿病和心血管疾病等慢性疾病方面存在潛在的應用價值。然而，麩皮酚類物質大多以結合態形式存在于細胞壁中，生物利用度比較低。目前，因其成本效益和環境優勢，固態發酵技術在促進麩皮酚類物質釋放發揮了重要作用。本文綜述了固態發酵技術、微生物資源挖掘，新型固態發酵策略等方面的最新進展，以期為麩皮的高值化利用提供一定參考。

1 麩皮中的酚類化合物

麩皮中富含具有生理活性的酚類物質，麩皮酚類物質通常以游離態和結合態形式存在(圖1)，大多數以不溶性形式結合在細胞壁結構中。游離酚一般不與其他分子發生物理和化學作用，通常易溶于極性水/有機溶劑，易于被人體腸道吸收。結合態多酚通常以酯鍵或醚鍵連接到細胞壁多糖上，或通過離子鍵嵌入食品基質大分子中。超過80%的阿魏酸在糊粉層和皮層中酯化成阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖，結合在細胞壁中；羥基苯甲酸通過羧基與細胞壁物質的羥基形成酯鍵。結合態形式存在的酚類物質，在消化道中的生物可及性較低，從而影響其生物活性。近年來，越來越多的研究表明，結合態形式存在的酚類物質其含量和抗氧化性能遠高于游離態[1]。因此，如何促麩皮酚類物質的高效釋放成為研究人員關注的熱點。

圖1 麩皮酚類化合物組成及其功能特性Fig.1 Composition and functional properties of phenolic compounds in bran

2 固態發酵技術

2.1 概述

由于麥麩中酚類活性物質在食品、化學和制藥工業中的潛在應用，人們對提取活性物質的發酵工藝愈發關注。從發酵體系狀態角度看，微生物發酵過程可分為2個類型：液態深層發酵(submerged fermentation，SMF)，是基于微生物在含有營養物質的液體培養基中的培養；固態發酵技術(solid-state fermentation，SSF)，包括微生物在無游離水(或接近無游離水)條件下在固體顆粒上的生長和產物形成。近年來，SSF可以實現農業廢棄物的再利用，屬于環境友好型的清潔生產技術，越來越受到研究人員的關注。由于其成本效益和環境優勢，固態發酵法已被確定為麩皮酚類物質釋放的有力工具[2]。YIN等[3]從麩皮中分離出一株黑曲霉菌株用于麩皮固態發酵，發現其顯著提高了麥麩中結合態阿魏酸的釋放，其抗氧化和抗炎活性明顯優于游離阿魏酸。對于固態發酵過程，基質含水量一般在30%～85%，較低值可誘導微生物的孢子形成，而更高的水平可降低系統的孔隙率，限制氧的傳遞，并增加細菌污染的風險。

2.2 發酵微生物

在固態發酵條件下，選擇合適的微生物菌株非常重要，發酵微生物的選擇直接決定最終SSF的效果。微生物發酵能夠提高麩皮中酚類物質含量，主要源于微生物定殖后細胞壁發生結構性破壞，導致酚類物質釋放；由于微生物在發酵過程中產生的不同木質素降解酶和水解酶的作用，結合的酚類物質被釋放；此外，一些可溶性酚類化合物可能被微生物合成[4]。目前，包括細菌類、酵母類、霉菌類在內的多種微生物可用于SSF過程，如表1所示。納豆桿菌(Bacillusnatto)處理小米麩皮，纖維素和半纖維素降解，形成更多的多孔性疏松結構，總酚含量和DPPH自由基清除能力增加[5]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum423)發酵處理米糠和小麥麩皮，抗氧化活性明顯增強，研究發現主要抗氧化活性成分為酸類(70.21%)和酮類(10.64%)，同時增強了硫化物和芳香族化合物等風味物質[6]。活性干酵母發酵大麥麩皮，多酚含量隨發酵時間延長而明顯增加，發酵6 d達到最高為420.4 μg GAE/mL，抗氧化性能也明顯提升[7]。相類似，釀酒酵母發酵米糠中酚類物質種類和含量增加，賦予米糠無麩餅干易接受的品質感觀屬性[8]。然而，由于發酵培養基中的低含水量，在SSF發酵體系中霉菌類一般是比較常用的微生物，特別是一些絲狀菌的菌絲能夠穿透麩皮介質，同時能夠分泌豐富酶系如淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶、幾丁質酶、蛋白酶、脂肪酶和β-半乳糖苷酶等，是生產酶制劑的優良細胞工廠。因此，絲狀菌在SSF產生生物活性物質中具有巨大的潛力[9]。

表1 不同類型微生物用于麩皮發酵Table 1 Different types of microorganisms used in bran fermentation

霉菌類如黑曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等，普遍應用于發酵食品生產，通常被認為是食品級微生物[10]。泡盛曲霉(AspergillusawamoriATCC 38854)和米曲霉(AspergillusoryzaeATCC 22787)固態發酵提高了黑米糠醇提物的抗氧化活性；總酚含量增加，原兒茶酸和阿魏酸增加最顯著，發酵3 d后達到最大值，泡盛曲霉發酵提取物為1 660.6 g/g[11]。ABD等[12]利用少孢根霉(RhizopusoligosporusF0020)和紅曲霉(MonascuspurpureusF0061)固態發酵米糠，酚類組成發生明顯變化，其中香草酸、咖啡酸和4-羥基苯甲酸發酵后顯著增加。絲狀類真菌發酵可以有效促進麩皮酚類物質的釋放，但在發酵體系中，菌絲往往緊密纏繞在麩皮介質中，精準定量絲狀菌的生物量相對困難，發酵過程菌體生長動態規律有待進一步闡明。我國傳統釀造食品歷史悠久，其中蘊藏著豐富的菌種資源庫，挖掘具有我國知識產權的“風土”微生物資源，并評價其功能特性，有望獲得促進麩皮酚類物質高效釋放的菌種資源。

3 驅動麥麩酚類物質釋放的策略解析

3.1 復合菌系發酵技術

單一菌系處理麩皮往往存在發酵效率較低的缺陷，限制了其在麩皮發酵中的應用。菌種間的代謝協同有助于提升SSF效果，可以通過菌種混合培養來實現。混合培養發酵是指由2種或2種以上微生物組成的發酵過程，實現混合培養菌種代謝的協同效應。近年來，微生物混合菌系發酵具有一系列優勢，可以通過菌種之間的分工來分配代謝負擔，具備有效轉化復雜底物的能力。SHAHAB等[16]構建了里氏木霉、兼性厭氧乳酸菌與專性厭氧乳酸菌共培養菌系，以纖維素與木糖混合底物發酵，獲得了0.35 g丁酸/g碳水化合物，高于可溶性底物或添加商業纖維素分解酶的轉化率。

絲狀真菌黑曲霉和米曲霉在麥麩平板中共培養，2種菌株分布均勻，并且混合培養物比單一培養分泌更多的細胞壁降解酶[17]。與單菌系培養相比，米曲霉和枯草芽胞桿菌混合培養，顯著提升了底物總酚含量，增強了底物營養特性[18]。紅曲霉和枯草芽胞桿菌共培養，發酵燕麥的總酚含量是未發酵燕麥的23倍，游離酚和結合酚的抗氧化活性增強[19]。紅曲霉(MonascusankaGIM 3.592)和釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeGIM 2.139)混合發酵石榴葉，石榴葉總酚含量特別是綠原酸、蘆丁和槲皮素的釋放明顯提升，顯示更強的DPPH自由基清除能力以及抗菌能力，提高了番石榴葉的藥用價值[20]。因此，通過優化2種或多種微生物共培養發酵體系，可以有效改善單一菌種發酵效率低的缺陷。

3.2 預處理耦合發酵技術

目前，一些新興的物理預處理方法如蒸汽爆破、超微粉碎、螺桿擠壓和微波加熱等技術，逐漸應用于纖維素輔助改性過程中，如表2所示。超微粉碎有助于增加麥麩顆粒表面積，提高其生物利用度，KONG等[21]采用蒸汽爆破輔助超細磨工藝，麩皮總酚含量明顯增加，自由基清除活力明顯增強。白酒產生的黃水預處理稻殼，顯著降低了稻殼硬度，增強了稻殼骨架結構的彈性[22]。微波加熱技術有助于破壞纖維結構而使其更易降解，DI等[23]研究了微波加熱輔助FeCl3催化水解纖維素，葡萄糖產率為39.9 mol%。LI等[24]利用EBI處理米糠纖維，發現纖維素的結晶區斷裂，木質素與半纖維素的連接斷裂。麩皮致密的細胞壁結構，往往需要一定預處理手段進行輔助改性，有利于后續固態發酵。發酵前對黑米糠的預熱處理顯著增加了酚酸的含量，尤其是阿魏酸和原兒茶酸。隨后的發酵進一步增加了黑米糠提取物中酚酸的含量；酚酸含量的增加導致抗氧化活性增加[11]。糙米經過螺桿擠壓處理，經過乳酸菌(LactobacillusfermentumGIM 1.985)與釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeGIM 2.213)混合發酵后，游離酚、共軛酚和結合酚均明顯增加，酚類組成中阿魏酸、對香豆酸、肉桂酸、山奈酚和槲皮素的含量較高，并具有較高抗氧化活性[25]。因此，預處理耦合麩皮發酵是提升麩皮酚類物質釋放的重要途徑。

表2 不同預處理技術用于麩皮改性Table 2 Different pretreatment used for wheat bran modification

3.3 菌酶協同發酵技術

許多研究發現酚類物質的含量與α-淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性有很好的相關性。α-淀粉酶處理燕麥，使沒食子酸含量提高了2.6倍(0.38 mg/g燕麥)，咖啡酸含量提高了2.4倍，其他酚類含量提高了1.0～1.8倍[32]。木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶處理小麥麩皮，可溶性低聚木糖和酚酸含量增加，抗氧化能力增強[33]。纖維素酶處理顯著提高了燕麥麩皮大多數酚類化合物的利用率，咖啡酸提高了97%，香蘭素提高了28%，對香豆酸提高了105%，阿魏酸提高了914%[34]。LIU等[35]通過糊化、液化和復合酶水解連續處理米糠，與單獨糊化相比，復合酶水解顯著提高總酚、黃酮含量，分別提高46.24%、79.13%；阿魏酸釋放量最大，其次是原兒茶酸，然后是槲皮素。然而，在發酵處理體系中，纖維素酶活性相對較低，這可能導致不溶性酚類物質不能充分釋放[36]。為進一步提高麩皮中酚類物質含量和生物活性，需要酶促降解麩皮細胞壁以釋放酚類物質，實現麥麩的菌酶協同發酵。

菌酶協同發酵技術，是在微生物發酵的同時添加復合酶制劑，可有效克服酶量分泌不足的缺陷。KATINA等[37]采用發酵法提高了黑麥麩皮總酚和游離阿魏酸的水平，在用天然谷物發酵麩皮的過程中，烷基間苯二酚含量略有增加，但在用去皮谷物發酵麩皮的過程中，烷基間苯二酚的含量有所下降，發現麩皮內源乳酸菌和谷物外層酶促進了發酵過程中麩皮的變化。植物乳桿菌(LactobacillusplantarumCECT 748)發酵與葡聚糖酶的水解相結合，提高了小扁豆在抗氧化、抗高血壓和降血糖方面的有益效果[38]。徐磊等[39]添加復合酶制劑(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶)協同干酪乳桿菌發酵薏米，多肽和總酚濃度顯著提高，抗氧化性能明顯高于單獨菌種發酵方式。纖維素酶能從燕麥中釋放出大量不溶性酚類物質，與傳統發酵體系相比，酶解發酵體系進一步提高了可溶性和不溶性酚類物質的含量(分別提高了24.38%和31.05%)，可溶性酚類物質中沒食子酸、綠原酸和阿魏酸的含量分別提高了42.49%、85.79%和46.42%[40]。相類似地，LIU等[41]分析乳酸菌發酵和復合酶水解顯著提高了α-淀粉酶蒸煮預處理米糠水溶液的總酚和抗氧化活性。因此，菌酶協同發酵技術也是實現麩皮高值化的重要途徑，因為它能夠通過增加生物活性化合物的含量和生物利用度來增強其營養特性。

4 展望

我國傳統發酵食品中蘊藏著豐富的菌種資源[42]，可以從中挖掘食品級微生物資源并評價其功能特性用于麩皮固態發酵過程。盡管SSF是生態友好型的，基于更低的能量需求和更少的廢水產生以及更低的細菌污染風險，在開發麩皮酚類物質中發揮了重要作用[43]。但SSF為三相非均相過程，包括固相、液相和氣相，此類培養過程往往存在熱量積聚、傳質和傳熱不均一性等問題。因此，提升固態發酵過程傳質和傳熱均一性，開發面向工業化的固態發酵反應器是未來麩皮固態發酵研究的重要方向。此外，結合新型固態發酵技術(圖2)如復合菌系發酵技術、預處理耦合發酵技術和菌酶協同發酵技術等策略在麩皮酚類物質釋放中的應用，為實現麩皮酚類物質工業化高效制備奠定基礎。

圖2 新型發酵策略在麩皮固態發酵中的應用Fig.2 Novel fermentation strategies applied in solid-state fermentation of bran