比較3種方法制備的農桿菌侵染玉米自交系‘B 104’幼胚的效率

馮鑫磊 李結平

(河南大學 生命科學學院/省部共建作物逆境適應與改良國家重點實驗室/棉花生物學國家重點實驗室，河南 開封 475004)

玉米是重要的農作物和基礎研究的模式植物，具有豐富的遺傳多樣性。高效的玉米遺傳轉化體系可用于培育農藝性狀更優的玉米品種，2019年全球已經商業種植轉基因玉米約6 090萬hm2[1]。遺傳轉化是創制研究材料，支撐分子生物學基礎研究的重要技術手段。

最早的玉米轉化采用電轉原生質體，但是沒有獲得可育的植株[2]，后來研究人員開發了一系列的方法，如對玉米幼胚或者懸浮細胞進行基因槍轟擊等，獲得了可育的玉米轉化植株[3-4]。但是這類利用壓力轟擊的物理方法會增加外源基因的拷貝數，出現目的基因片段斷裂等不可控問題[5]。農桿菌介導轉化具有穩定遺傳和插入片段拷貝數低等優點，它被廣泛應用于作物農藝性狀改良和植物基礎研究。1996年首次成功實現了農桿菌介導的玉米遺傳轉化[6]，此后流程中的各種關鍵因子，如載體、菌株、組織培養基、外植體和愈傷培養條件一直在優化，玉米遺傳轉化效率在不斷的提高[7-8]。但是作為模式植物，玉米的遺傳轉化效率偏低，制約了玉米功能基因的基礎研究和分子育種的發展。

以自交系為受體減少了雜交種(‘HiII’材料)為受體的背景純合過程，有利于基因功能研究。玉米公共自交系‘B 104’是經典轉化受體材料，它由Iowa Stiff Stalk Synthetic(BSSS)群體，BS13(S)C5選育出來，與玉米研究中廣泛應用的自交系‘B 73’具有60%的遺傳相似性[9]。因其自身農藝性狀特點和較強的再生能力，國際玉米研究機構如愛荷華州立大學植物轉化中心及多家國內玉米轉化服務公司均選擇將其作為玉米轉化的受體材料。

瞬時轉化效率與遺傳轉化陽性效率呈現高度的正相關關系，使用活力強的農桿菌侵染適宜的幼胚是農桿菌介導轉化成功最關鍵的步驟之一。農桿菌的制備方法影響農桿菌活性，但是針對玉米轉化，當前制備農桿菌一般采用LB培養基或者YEP培養基，比較單一。AB微量礦質培養基應用于玉米的遺傳轉化僅有少量報道[10]，而在受體‘B 104’上的應用未見報道，農桿菌培養方法對侵染效率影響的研究也鮮見報道。本研究分別選用YEP培養基與AB微量礦質培養基對玉米自交系‘B 104’幼胚進行侵染，分析不同方法制備的農桿菌侵染效率，旨在探究提高農桿菌侵染效率的最優制備方法，以期為提高玉米幼胚瞬時轉化效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要培養基的制備

AB液體培養基：20 g/L葡萄糖(Glucose)，19.52 g/L 2-(N-嗎啡吡啉)乙磺酸(MES)，1 g/L氯化氨(NH4Cl)，0.3 g/L七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)，0.002 5 g/L七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，150 mg/L氯化鉀(KCl，母液濃度150 mg/mL)，10 mg/L氯化鈣(CaCl2，母液濃度10 mg/mL)，1 mL/L磷酸二氫鈉(NaH2PO4，母液濃度0.5 mol/L)，使用KOH調節pH至5.4，高壓濕熱滅菌115 ℃，15 min。使用時，每升培養基加入2 mL乙酰丁香酮(AS，母液100 mmol/L)，1 mL利福平(Rifampicin，母液濃度25 mg/mL)，1 mL卡那霉素(Kanamycin sulfate，母液濃度50 mg/mL)[11]。YEP液體，固體培養基及其他培養基，如侵染培養基，共培養培養基，選擇培養基參考Raji等[12]。采用YEP固體平板劃單克隆的方式活化菌株。

1.2 3種不同的農桿菌制備方法

采用農桿菌EHA 105和植物雙元表達載體pCAMBIA 3301為侵染菌株和表達載體，挑取EHA 105-pCAMBIA 3301母板上的單克隆菌落，加至5 mL含有卡那霉素(kan)和利福平(rif)的YEP液體培養基中，28 ℃，180 r/min，搖菌。12 h后，分別采用3種不同方法處理：

YEP液體培養基制菌：取其中1 mL菌液加入新制備的10 mL含有抗生素(kan和rif)的YEP液體培養基中，28 ℃，180 r/min，搖菌12 h后，25 ℃，3 500 r/min，離心10 min收集菌落。

YEP固體培養基制菌：使用接菌環取活化的菌液在含有抗生素(kan和rif)的YEP平板上劃S形的條紋。倒置放置于28 ℃生化培養箱，黑暗培養12 h，用接菌環刮取菌落。

AB液體培養基制菌：25 ℃，3 500 r/min，離心10 min收集菌體，使用10 mL含有kan、rif和乙酰基丁香酮(AS)的AB液體培養基重懸菌落，調節菌液濃度，使得OD550=0.1，28 ℃，180 r/min，搖菌12 h后，25 ℃，3 500 r/min，離心10 min收集菌落。

菌體收集后，使用含有AS的侵染培養基重懸菌液，紫外分光光度計調節菌液濃度，使得OD550=0.3。

1.3 農桿菌侵染玉米幼胚程序

將制備好含菌的侵染液放置于室溫搖床上，100 r/min，30 min。取授粉后12 d的玉米雌穗，挑取長度約2 mm的幼胚放入制備好的含菌侵染液中，剝取過程約30 min。上下輕柔顛倒含有幼胚和菌液的2 mL離心管20次，靜止放置5 min，吸除多余菌液，將侵染后的幼胚轉移至共培養培養基，24 ℃黑暗培養3 d。每種制備方法侵染3次，每次3個重復。

1.4 GUS染色

根據Jefferson RA方法對共培養3 d的幼胚進行GUS染色[12]，將幼胚放入GUS染液中，37 ℃暗培養12 h處理后轉移至體視鏡觀察染色結果，統計藍色斑點的幼胚和染色面積占幼胚面積30%～50%的幼胚數量[7]。

1.5 轉移幼胚至篩選培養基

共培養3 d后，將幼胚轉移至篩選培養基(含有‘草銨膦’)，保持幼胚盾片面朝上，每皿約30個幼胚，于28 ℃黑暗條件下繼續培養。10 d后統計胚性愈傷的形成數量及比例。

1.6 陽性轉化率

分別使用YEP液體和AB液體培養基制備含有不同載體的農桿菌進行幼胚侵染，其中用YEP液體培養基分別制備含有8個不同基因載體的農桿菌EHA 105，用AB液體培養基分別制備含有18個不同基因載體的農桿菌EHA 105，用于每個載體侵染的幼胚數為400～800個，分析比較2種方法陽性轉化率。

1.7 數據分析

運用spss16.0軟件對試驗數據進行獨立樣本Student’s t-test和ANOVA分析，采用Duncan多組樣本間差異顯著性分析(P=0.05)。

2 結果與分析

2.1 GUS染色差異

由圖1可知，YEP液體培養基制菌侵染后出現藍色斑點的幼胚數量占總體幼胚數量比率為60%，YEP固體培養基制菌成功瞬時侵染比率為42%，AB液體培養基制菌侵染后所有幼胚都含有藍色的斑點，瞬時侵染比率為100%，幼胚GUS染色顏色加深(圖1(c))。

由圖2可知，YEP液體培養基侵染產生的符合高效轉化的侵染幼胚(面積達到30%～50%)占幼胚總數量比率為10%，YEP固體培養基制菌侵染后，沒有出現此種幼胚，單次處理30個幼胚中有1～2個幼胚藍色面積占比達到10%。AB液體培養基處理高效轉化幼胚數量占比約為40%(圖2(b))。結果表明，AB液體培養基制菌瞬時轉化效率最高，出現GUS染色幼胚比率和浸染面積≥30%幼胚比率均顯著高于YEP液體和YEP固體培養基。因此，針對玉米自交系‘B 104’，3種培養基制備的EHA 105-pCAMBIA 3301介導瞬時轉化效率由高到低為：AB液體培養基>YEP液體培養基>YEP固體培養基。

不同小寫字母表示不同方法之間差異顯著(P<0.05)。Different letters represent significant difference among methods (P<0.05).圖2 3種方法制備農桿菌侵染幼胚瞬時轉化效率(a)和侵染面積≥30%幼胚比率(b)的差異Fig.2 Differences in the transient transformation efficiency (a) and rate of immersion area greater than 30% (b) of immature embryos infected by three methods prepared Agrobacterium

2.2 胚性愈傷差異

由圖3可知，經過誘導生長，與YEP液體和AB液體培養基相比，YEP固體培養基(圖3(b))誘導的愈傷形狀較小。而YEP液體和AB液體培養基制備的處理組，瞬時侵染率高，幼胚受到侵染的細胞顯著多于YEP固體培養基(圖1(a)和(c))，在選擇培養基上，愈傷誘導產生較大的抗性愈傷，此結果也與之前GUS染色指示瞬時表達效率的結果一致(圖1)。

白色箭頭指示胚性愈傷White arrows indicate embryogenic calluses圖3 YEP液體(a)，YEP固體(b)和AB液體(c)培養基制備農桿菌侵染幼胚的胚性愈傷Fig.3 Embryogenic callus induced from immature embryo infected with preparation methods of Agrobacterium by YEP liquid (a), YEP solid (b) and AB liquid medium (c)

由圖4可知，經過10 d的篩選處理，不同制備方法侵染幼胚后經過篩選培養基誘導產生的胚性愈傷比例差異顯著，其中YEP液體培養基制菌處理的愈傷誘導率為27%，YEP固體培養基制菌處理方式為13%，AB液體培養基制菌方式愈傷誘導率最高，達到49%。3種培養基制備農桿菌的幼胚誘導胚性愈傷的比率由高到低為：AB液體培養基>YEP液體培養基>YEP固體培養基，差異達到顯著性水平。這一結果與GUS染色結果表征的瞬時轉化效率結果相符(圖2)。

圖4 3種方法制菌侵染幼胚胚性愈傷誘導率差異Fig.4 The induction rate of embryogenic calluses in immature embryos infected by three different methods prepared Agrobacterium

2.3 陽性轉化率差異

如圖5所示，YEP液體培養基方法的陽性轉化率平均為2.74%，AB液體培養基的陽性轉化率平均為5.46%，顯著高于YEP液體培養基制備方法(P<0.05)，表明AB液體培養基在大量轉化操作時可顯著提高轉化效率，在瞬時侵染時提高了侵染效率和轉化陽性率。

*表示不同方法之間差異顯著(P<0.05)。* Represent significant difference among methods (P<0.05).圖5 YEP液體和AB液體培養基方法陽性轉化率比較Fig.5 The difference of positive transformation between YEP liquid and AB liquid medium methods prepared Agrobacterium

3 討 論

為增加農桿菌的侵染能力，重組蛋白工業生產領域已有對農桿菌制備方法的優化研究[13]。AB培養基是一種以簡單碳水化合物為糖源，包含少量礦質元素的最簡培養基(Minimal Media)，最早見于農桿菌生長的放射性標記研究[15]，更多地應用于工業領域農桿菌的培養，如農桿菌介導煙草瞬時轉化表達具有藥用價值的植物蛋白[9]。

YEP固體培養基廣泛應用于多種植物的遺傳轉化，如擬南芥[16]，中國白菜(Brassicarapassp. Pekinensis)[16]等。以YEP或者LB固體培養基劃線生長菌落的方法廣泛應用于玉米的遺傳轉化，在不同的報道中轉化效率差異很大[6-7,17-19]。但是在本研究中，YEP固體培養基制備的農桿菌侵染未產生面積比例超過30%的幼胚，因為劃線的菌株經過搖菌活化，28 ℃黑暗培養12 h后，在平板表面堆積了大量的菌落，可能造成底層的菌落生長時間過長而死亡，僅頂端存在新生長的菌落具有侵染活性，重懸于侵染培養基后包含了死亡菌落，影響了瞬時轉化效率。農桿菌的活化通常在YEP液體培養基中進行。YEP液體培養基可以應用于玉米[20]，大豆[21]和煙草[22]等遺傳轉化。

含有不同外源基因質粒的農桿菌在YEP培養基中的生長速度不相同，加之甘油管保存菌液濃度的差異，致使固定時間內保持相同菌液濃度比較困難，本研究中采用相同的制備程序，先使用YEP液體培養基活化保存于甘油管中的菌株，然后分別使用YEP液體和AB液體培養基進行擴搖。在YEP液體培養基中，菌株生長速度很快，短時間內菌落大量積累，菌落生長環境惡化，產生死亡菌體，可能是本研究中出現侵染面積≥30%幼胚較少的原因。在AB液體培養基的處理組中，菌株生長緩慢[15]，菌株的活性保持好，侵染時菌株處于指數生長期，避免了最初菌液濃度差異的影響。相對于YEP液體制菌處理，AB培養基制備的農桿菌侵染玉米幼胚GUS染色的顏色更深，可能侵染深層細胞，增加了侵染細胞的數量，進而保證了篩選培養過程中更高的胚性愈傷比率，應進一步對顯色后的幼胚進行切片觀察驗證。在使用大量幼胚，多種載體進行遺傳轉化時，使用AB液體培養基侵染方法顯著提高了陽性轉化率。當前普遍采用的玉米轉化技術體系要求轉化受體為大小合適的幼胚，侵染的最佳時期只有1～2 d，所以對菌液的活性和操作的穩定性要求很高，與雙子葉植物(如煙草和擬南芥等)有很大的差別。本研究的結果表明，針對玉米自交系‘B 104’的幼胚，AB液體培養基制備農桿菌侵染效率更高。

對AB培養基的優化研究結果已經應用于AB培養基的改良，如采用阿拉伯糖(arabinose)或者葡萄糖(glucose)作為碳源，可以提高外源蛋白表達水平[23]；酸性的環境(pH 5.4)可以增加VIR基因的表達，培養基的配方中加入19.52 g/L MES穩定pH，減少酸性環境對農桿菌生長的不利影響[24]；在共培養培養基加入AB培養基能顯著增加農桿菌對擬南芥幼苗的瞬時侵染效率，培養基pH 5.5對侵染效率有顯著提升作用[24]，可以應用于玉米轉化，提高瞬時轉化效率。根據本實驗室的經驗，制備AB培養基過程中需要嚴格試劑的用量，避免產生微小沉淀，致使菌落成團生長，試驗條件允許的情況下，宜采用過濾滅菌的方式，避免沉淀的產生。本試驗結果表明相對于傳統的YEP培養基，AB液體培養基制備的方法能顯著提高農桿菌對玉米‘B 104’幼胚的瞬時侵染效率和抗性胚性愈傷的比率，可以應用于玉米自交系‘B 104’遺傳轉化的工藝改良，最終提高玉米遺傳轉化陽性率。未來也可以應用于其他的玉米受體材料，如‘H 99’，‘綜31’和‘A 188’等，從而滿足玉米育種和基礎研究中創制材料的需求。

4 結 論

本研究結果表明，AB液體培養基制備的農桿菌侵染玉米自交系‘B 104’幼胚的侵染率達到100%，染色面積≥30%的幼胚占比為40%，均顯著高于YEP固體和液體培養基制備的農桿菌，AB液體培養基制菌侵染的幼胚在選擇培養基上產生的胚性愈傷的比率為49%，顯著高于YEP固體和液體培養基制備的農桿菌(P<0.05)，AB液體培養基制備的農桿菌侵染幼胚的轉化苗陽性轉化率顯著高于YEP液體培養基。因此，使用AB液體培養基制備農桿菌可以有效地提高對玉米自交系‘B 104’幼胚的瞬時侵染率，獲得更多的胚性愈傷。