山羊KLF16對肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響

李 鑫 張 浩 王佳美 王 永 俄木曲者 李艷艷 朱江江 林亞秋*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院 動物遺傳育種重點實驗室，成都 610066)

山羊脂肪組織按沉積部位的不同可以分為皮下脂肪組織(SAT)、肌內(nèi)脂肪(IMF)和內(nèi)臟脂肪組織(VAT)等，其中肌內(nèi)脂肪(IMF)含量影響山羊肉質(zhì)，主要包括風(fēng)味和多汁性[1-2]。IMF的沉積是前體脂肪細胞不斷聚脂，分化為成熟脂肪細胞的過程[3]。因此通過探索肌內(nèi)脂肪細胞分化機制來分析脂肪沉積的調(diào)控機理對山羊乃至經(jīng)濟畜種肉質(zhì)改良具有重大意義。

已有研究證明，CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)，從而激活成脂分化進程[4]，然而脂肪細胞分化是一個復(fù)雜生物學(xué)進程，同時受諸如類維生素X受體Alpha(RXRα)和Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(Krüppel-like factors，KLFs)等多種基因和轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控，它們是脂肪細胞分化進程中不可或缺的重要調(diào)控因子[5-8]。其中，KLFs共計18位成員，廣泛分布于哺乳動物細胞內(nèi)，通過由3個連續(xù)的C2H2型鋅指構(gòu)成的鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA中的GC-rich區(qū)，以直接與靶基因結(jié)合或與其他輔助調(diào)節(jié)因子組合成調(diào)節(jié)復(fù)合物的方式，廣泛參與到真核細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的表達調(diào)控[9-11]。

研究顯示，KLFs家族成員在脂肪細胞分化過程中扮演重要角色，且對脂肪細胞分化調(diào)控作用具有物種特異性，如KLF13促進豬前體脂肪細胞的分化，但對小鼠前脂肪細胞分化無影響[12]；實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)KLF3和KLF10促進山羊肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞分化[13-14]，但卻是小鼠脂肪生成的負(fù)調(diào)控因子[15-16]；以上研究提示KLF家族基因在脂肪細胞分化方面的調(diào)控作用具有物種差異性。KLF16自2002年被發(fā)現(xiàn)以來[17]，對其研究多集中在胰腺癌細胞轉(zhuǎn)化[18]、神經(jīng)細胞生長及突觸形成、內(nèi)分泌系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[19]、子宮內(nèi)膜生理和代謝[20]及多巴胺信號的傳導(dǎo)[21]等方面，表明KLF16在多種生物學(xué)過程中具有重要調(diào)控作用。而KLF16在脂肪方面的研究直至2016年才被報道，即Jang等[22]研究發(fā)現(xiàn)干擾KLF16基因表達可以刺激小鼠棕色和白色前體脂肪細胞分化，而過表達KLF16會以濃度依賴性方式降低PPARγ啟動子活性，從而抑制脂肪生成，提示KLF16對脂肪細胞分化具有調(diào)控作用，且尚未見除小鼠外其他物種的KLF16基因在脂肪細胞分化方面的作用。此前本實驗室利用高通量測序發(fā)現(xiàn)KLF16為山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化前后的差異調(diào)控基因，但其具體的調(diào)控作用機制尚不清楚，該基因目前僅豬中存在克隆序列[23]，牛和綿羊僅見預(yù)測序列，山羊KLF16基因序列與現(xiàn)有研究是否存在差異，是否導(dǎo)致不同的基因功能，需要深入研究。且基于上述KLFs成員對不同物種脂肪細胞分化調(diào)控作用的物種特異性，不能僅以小鼠中的報道為參考，需要以體外培養(yǎng)的山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞為研究對象進行功能研究。

因此本研究首先利用RT-PCR技術(shù)克隆山羊KLF16基因序列，然后利用熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)檢測該基因在山羊不同組織及不同誘導(dǎo)分化階段肌內(nèi)脂肪細胞中的表達模式，構(gòu)建其組織及細胞時序表達譜，利用過表達及生物信息學(xué)預(yù)測等手段明確KLF16基因?qū)ι窖蚣?nèi)前體脂肪細胞分化的影響及可能的作用機制，為最終闡明KLF16對山羊前體脂肪細胞分化的調(diào)控機制及經(jīng)濟畜種的肉質(zhì)改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗樣品的采集

選擇四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司種羊場健康的6～8月齡(育成羊)簡州大耳羊公羊作為研究對象(n=4)。晨間屠宰后迅速采集其心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、背部皮下脂肪和腹部皮下脂肪組織，用DEPC水清洗除去血漬后立即用錫箔紙包裹好分裝入凍存管中，置入液氮中凍存并帶回實驗室進行后續(xù)實驗。原代肌內(nèi)脂肪細胞由實驗室前期分離保存[24]。

1.1.2主要材料

山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞(本實驗室保存)；Trizol、PMD-19T載體和SYBR?Premix Ex Taq TM(2×)購自TaKaRa；DNA純化試劑盒和2×GC-rich PCR Master Mix購自TIANGEN；TreliefTM5α購自北京擎科生物科技有限公司，胎牛血清、雙抗和胰酶購自Gibco；DEME/F12培養(yǎng)基購自Hyclone；油酸購自Sigma；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher；過表達腺病毒載體HBAD-KLF16-EGFP和對照腺病毒載體HBAD-EGFP的構(gòu)建及過表達山羊KLF16的重組腺病毒和對照重組腺病毒的包裝均由漢恒生物科技(上海)有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1山羊KLF16基因克隆及生物信息學(xué)分析

取保存于液氮中的山羊組織樣品約0.2 g，用Trizol法提取組織樣品中的總RNA，經(jīng)過IMPLEN NanoPhotometer?N60 超微量分光光度計測定RNA樣品質(zhì)量濃度，A260/280和 A260/230的值均>2.0，取1 μg的total RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI上綿羊KLF16基因預(yù)測序列(XM_012116067.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計克隆引物(表1)。共25 μL的反應(yīng)體系(山羊背最長肌cDNA 2 μL、2×GC-rich PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL)按照94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共38個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收產(chǎn)物，用PMD-19T 載體連接并轉(zhuǎn)化至TreliefTM5α感受態(tài)細胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后挑菌，擴大培養(yǎng)的菌液用PCR鑒定，將符合目的條帶大小的樣品送至北京擎科生物技術(shù)有限公司成都分公司測序。

表1 克隆和熒光定量PCR引物信息Table 1 Information of primers for cloning and quantitative real-time PCR

表1(續(xù))

對測序獲得的序列進行生物信息學(xué)分析，分析內(nèi)容及對應(yīng)的工具如表2。

表2 山羊KLF16序列分析內(nèi)容及相應(yīng)分析工具Table 2 Sequence analysis content and corresponding analysis tools of goat KLF16

1.2.2山羊KLF16在組織及細胞時序表達分析

選用UXT和GAPDH為內(nèi)參基因，qPCR檢測KLF16在山羊不同組織和不同分化階段肌內(nèi)脂肪細胞中的表達水平，引物信息如表1。山羊各組織cDNA由1.2.1獲得。

沿用本實驗室前期的方法將山羊原代肌內(nèi)脂肪細胞復(fù)蘇培養(yǎng)[14]， F3代細胞生長到80%左右時，加入含50 μmol/L油酸的培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化，分別收集0、1、2、3、4、5和6 d的細胞，用Trizol法提取細胞中的總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將獲得的cDNA原液5倍稀釋后即獲得細胞時序cDNA。qPCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL， SYBR?Premix ExTaqTM (2×)10 μL，用ddH2O補充至20 μL。95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，66 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。

1.2.3山羊KLF16在肌內(nèi)前體脂肪細中的過表達

將F3代山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞按4×104個/孔接種于12孔板，待融合度達80%后根據(jù)腺病毒小體積感染表(漢恒生物科技(上海)有限公司)用3 μL 攜帶目的基因的重組腺病毒(HBAD-KLF16-EGFP)感染細胞24 h(病毒滴度為1.26×1010PFU/mL)，獲得KLF16過表達組(Overexpression, OE)，陰性對照組(Negative control, NC)，用不攜帶目的基因的空載腺病毒(HBAD-EGFP)感染細胞；然后更換為50 μmol/L 油酸的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2 d，觀察細胞內(nèi)綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況并收集細胞用于后續(xù)實驗，細胞總RNA的提取和cDNA的獲得方法同1.2.1。

1.2.4過表達KLF16對山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響

1.2.4.1 油紅O染色觀察脂滴形成情況

用油紅O染色法檢測誘導(dǎo)分化前后山羊肌內(nèi)脂肪細胞中脂滴的變化，用于染色的細胞接種于24孔板，過表達KLF16兩天后移除培養(yǎng)基，PBS洗滌三遍后用中性甲醛(10%)固定30 min，移除甲醛，重復(fù)PBS洗滌，然后加入適量的油紅O染液染色20 min，移除染液后用PBS多次洗滌，在顯微鏡下觀察并拍照。隨后根據(jù)油紅O染色提取法，每孔加入1 mL異丙醇溶解脂滴中吸附的油紅O染料，轉(zhuǎn)移至96孔板中測定490 nm時的吸光度值(OD值)以量化染色結(jié)果。

1.2.4.2 分化標(biāo)志基因及家族其他成員表達變化

用qPCR檢測過表達KLF16后KLFs和分化標(biāo)志基因的表達情況，反應(yīng)體系同1.2.3，引物信息同表1。

1.2.5數(shù)據(jù)處理及分析

用2-ΔΔCt法處理qPCR數(shù)據(jù)結(jié)果，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用SPSS 18.0檢驗數(shù)據(jù)顯著性。P<0.05表示存在顯著差異；P<0.01表示存在極顯著差異。KLF家族基因表達量的相關(guān)性分析由Excel相關(guān)程序完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊KLF16基因克隆及生物信息學(xué)分析

克隆得到山羊KLF16基因序列全長986 bp(圖1(a))，包含756 bp完整的CDS區(qū)序列，編碼251個氨基酸，功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示KLF16具有3個相鄰的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，分別位于128～150、158～180和188～208位氨基酸(圖1(b))。山羊KLF16蛋白分子量大小為25.597 ku，理論等電點為10.17，無信號肽，不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位顯示其主要定位于細胞核。山羊KLF16蛋白具有29個O-糖基化位點，不含有N-糖基化位點；含有25個絲氨酸(S)磷酸化位點，5個蘇氨酸(T)磷酸化位點和1個酪氨酸(Y)磷酸化位點。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示山羊KLF16具有3個鋅指結(jié)構(gòu)，佐證了功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測的結(jié)果(圖1(c))。蛋白質(zhì)互作分析顯示KLF16可能與CYP1A1、KLF6、SIN3A、MITD1和IRF2BP1等蛋白質(zhì)間存在相互作用(圖1(d))。

(a)PCR擴增KLF16基因；(b)KLF16鋅指結(jié)構(gòu)域位點；(c)KLF16蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；(d)KLF16相互作用預(yù)測(a) Amplication of KLF16 gene by PCR; (b) KLF16 zinc finger domain site; (c) KLF16 protein tertiary structure prediction; (d) KLF16 interaction prediction圖1 山羊KLF16基因克隆及序列分析Fig.1 Clone and sequence analysis of goat KLF16 gene

山羊KLF16氨基酸序列與綿羊高度相似，達到99.47%，與牛也存在較高相似性(圖2(a))。進化樹顯示山羊KLF16與綿羊、牛親緣關(guān)系較近(圖2(b))。

圖2 KLF16氨基酸相似性比對(a)與進化樹分析(b)Fig.2 KLF16 amino acid similarity comparison (a) and evolutionary tree analysis (b)

2.2 山羊KLF16基因組織和細胞表達模式

qPCR 結(jié)果顯示，KLF16在育成羊各組織中廣泛表達，在腹部皮下脂肪中表達量最高(P<0.01)；同時在肺臟中的表達水平也顯著高于其他組織(P<0.05)(圖3(a))。

KLF16在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的0～6 d均有表達且存在差異，呈現(xiàn)先劇增后下降的特點。KLF16在1 d的表達量達最高水平，且極顯著高于分化前和其他分化過程(P<0.01)，而在2～6 d內(nèi)持續(xù)低表達(圖3(b))。

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母為差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different uppercase letters in the data of the same peer group indicate that the difference is extremely significant (P<0.01), and different lowercase letters indicate that the difference is significant (P<0.05).圖3 山羊KLF16在不同組織(a)和肌內(nèi)前體脂肪細胞(b)的表達量Fig.3 The expression levels of goat KLF16 in different tissues(a) and intramuscular preadipocytes (b)

2.3 過表達KLF16對山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響

2.3.1過表達山羊KLF16對肌內(nèi)脂肪細胞脂滴積聚的影響

鏡下觀察誘導(dǎo)兩天的細胞綠色熒光蛋白的表達，利用ImageJ軟件計算圖片熒光區(qū)域，NC組綠色熒光占圖片46.62%，OE組綠色熒光占圖片46.32%，NC組和OE組熒光表達量相當(dāng)，說明感染效率基本一致，可以進行后續(xù)觀察和分析(圖4(a)和(c))。qPCR檢測KLF16過表達效率，顯示KLF16極顯著(P<0.01)上調(diào)達到約1 500倍(圖4(e))，油紅O染色觀察到過表達KLF16后細胞內(nèi)脂滴生成減少(圖4(b)), 油紅O染色提取法OD值也呈現(xiàn)相同的結(jié)果(圖4(d))。

(a)NC組與OE組細胞內(nèi)熒光表達情況(40×)；(b)油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴積聚情況；(c)NC組與OE組熒光相對表達面積；(d)OD值量化油紅O染色結(jié)果；(e)NC組與OE組KLF16相對表達量(a) Fluorescence expression in adipocytes of NC group and OE group (40×); (b) Oil red O staining to observe the accumulation of intracellular lipid droplets; (c) Relative fluorescens area of NC group and OE group; (d) OD value quantifies the Oil red O staining results; (e) Relative expression of KLF16 in NC group and OE group**表示P<0.01，*表示P<0.05，下同。** means P<0.01, * means P<0.05. The same below.圖4 過表達KLF16后形態(tài)學(xué)觀察及效率檢測Fig.4 Morphological observation and efficiency detection after overexpression of KLF16

2.3.2過表達山羊KLF16對肌內(nèi)脂肪細胞分化標(biāo)志基因及KLFs的影響

為探究KLF16在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化中的作用機制，本研究檢測分化標(biāo)志基因相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)PPARα、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ均表現(xiàn)為下調(diào)，且PPARα和PPARγ表達極顯著水平(P<0.01)(圖5(a))。預(yù)測KLF16保守結(jié)合域如圖5(b)所示，且與PPARα、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ啟動子區(qū)域存在多個結(jié)合位點(圖5(c))。

(a)分化標(biāo)志基因檢測；(b)KLF16 DNA結(jié)合域預(yù)測；(c)KLF16與基因的啟動子結(jié)合關(guān)系預(yù)測；(d)KLFs表達直方圖；(e)KLFs成員與KLF16的表達相關(guān)性分析；(f)KLF16與KLF8啟動子結(jié)合位點預(yù)測。(a) Detection of differentiation marker genes; (b) Prediction of KLF16 DNA binding motif; (c)Prediction of KLF16 binding sites with genes promoter; (d) Histogram of KLFs expression; (e) The expression correlation analysis of KLFs with KLF16; (f) Prediction of KLF16 binding sites with KLF8 promoter.圖5 山羊KLF16調(diào)控肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的作用途徑分析Fig.5 Analysis of the role of goat KLF16 in regulating the differentiation of intramuscular preadipocytes

為探討KLF16是否通過與其他KLF成員之間相互作用來發(fā)揮調(diào)控作用，qPCR檢測過表達KLF16后KLFs的表達(圖5(d))，發(fā)現(xiàn)除KLF2、5、6和10之外其他成員的表達均發(fā)生顯著變化，其中KLF7和KLF15表達分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)上調(diào)，KLF1、9和14顯著下調(diào)(P<0.05)，KLF3、4、8、11～13和17極顯著下調(diào)(P<0.01)。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson,r)表征過表達KLF16后KLFs之間的表達關(guān)系，顯示家族成員之間存在一定程度的相關(guān)表達，且KLF16與KLF1、KLF8和KLF14存在正相關(guān)(r>0.7)，與KLF4、KLF5和KLF10存在負(fù)相關(guān)(r<-0.7)(圖5(e))，預(yù)測KLF16與KLF8啟動子存在結(jié)合位點(圖5(f))。

3 討 論

3.1 山羊KLF16基因克隆及分子特性

本研究克隆得到山羊KLF16基因序列，分析發(fā)現(xiàn)該序列具有KLF家族典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。山羊KLF16的鋅指結(jié)構(gòu)中，前2個鋅指均由23個氨基酸組成，第三個鋅指由21個氨基酸組成，符合KLF家族鋅指保守規(guī)律，與現(xiàn)有人和豬方面的報道一致[23,25]。已知C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合DNA序列[26], 從而調(diào)控基因的表達進而發(fā)揮作用，推測山羊KLF16可能通過C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域發(fā)揮調(diào)控作用。山羊KLF16第一鋅指前六肽為“AAKSHR”，包含3個堿性氨基酸，主要分布于細胞核，這與Song等[27]報道在KLF16在T淋巴細胞中具有核定位序列相似。山羊KLF16氨基端的AAVDL，屬于保守的A(A/V)XXL基序[23]，該基序可招募轉(zhuǎn)錄共抑制因子Sin3A抑制靶基因表達[28]。蛋白質(zhì)互作分析顯示山羊KLF16與KLF6、KLF8、CYP1A1、SIN3A、MITD1和IRF2BP1等可能存在相互作用。其中已證實KLF6、KLF8促進小鼠脂肪細胞分化，KLF6與HDAC3在DLK1啟動子上相互作用抑制DLK1基因表達，從而促進3T3-L1脂肪細胞的分化[29]，還通過干擾PPARα的表達從而達到的促進分化的作用[30]；而KLF8則是通過增強PPARγ2和C/EBPα啟動子活性促脂肪細胞分化[31-32]。細胞色素CYP1A1通過促進肝臟脂肪酸ω氧化過程，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[33-34]。IRF2BP2是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的新型調(diào)節(jié)器，且在KLF2轉(zhuǎn)錄激活過程中必需IRF2BP2的參與[35]，同時KLF2已被證實是山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化的負(fù)調(diào)控因子[24]。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)山羊KLF16氨基酸序列與綿羊的相似性更高，其次為牛，符合物種進化規(guī)律。

3.2 山羊KLF16的表達特性

明確基因表達特性是闡明基因功能的基礎(chǔ)。NCBI上收錄的小鼠組織表達數(shù)據(jù)(Gene ID: 118445)顯示KLF16在成年小鼠子宮、腎上腺、脾表達量相對較高，在生殖系統(tǒng)脂肪墊和皮下脂肪中也存在較高表達；此外，豬(Gene ID: 100302638)KLF16在子宮中表達水平最高，其次為脾、肺、心臟和皮下脂肪等組織。本研究發(fā)現(xiàn)KLF16在山羊各組織中廣泛表達，尤以腹部皮下脂肪中高表達，其次為肺臟。與上述結(jié)果存在差異，可能是物種差異造成的。本研究發(fā)現(xiàn)KLF16在山羊腹部皮下脂肪組織中的高表達，提示其可能對脂肪沉積存在影響。本研究發(fā)現(xiàn)KLF16在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化0～6 d均存在表達，但表達趨勢與Jang等[22]研究結(jié)果存在差異，Jang等研究表明KLF16在小鼠棕色脂肪細胞和3T3-L1前脂肪細胞分化0 d的表達量最高，隨后逐漸降低。這種差異可能是由于物種特異性和不同取材部位兩方面的影響，Jang實驗中的小鼠前體脂肪細胞取材于皮下，而本研究中山羊前體脂肪細胞來源于背最長肌，肌內(nèi)脂肪與肌纖維面積和直徑等表型具有正相關(guān)，對前脂肪細胞分化過程可能也有影響[36]。

3.3 山羊KLF16在脂肪細胞分化中的作用

在明確山羊KLF16組織及肌內(nèi)脂肪細胞分化表達模式的基礎(chǔ)上，本研究利用HBAD-KLF16-EGFP重組病毒感染體外培養(yǎng)的山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞，使其過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，過表達后細胞內(nèi)脂滴積聚減少，這與Jang等[22]的研究結(jié)果相似，Jang等研究表明KLF16是小鼠脂肪生成中的負(fù)調(diào)控因子。為了確定過表達山羊KLF16減少肌內(nèi)脂肪細胞脂滴積聚的可能機制，本研究檢測了脂肪細胞分化標(biāo)志基因PPARγ、PPARα、C/EBPα 和C/EBPβ的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARγ、PPARα和C/EBPβ均存在顯著下調(diào)，推測可能通過調(diào)控這些基因的表達來發(fā)揮作用。且通過ALGGEN PROMO程序預(yù)測，山羊KLF16在PPARα、PPARγ和C/EBPα啟動子區(qū)存在多個結(jié)合位點。Sun等[37]指出過表達KLF16通過直接結(jié)合PPARα的啟動子來加速小鼠脂肪酸氧化并減弱線粒體應(yīng)激和氧化應(yīng)激，從而減少脂質(zhì)沉積，與本實驗結(jié)果相似?，F(xiàn)有研究證實PPARs與C/EBPs做為典型的脂肪組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，具有協(xié)同作用[38-39]，因此推測KLF16可能通過直接結(jié)合PPARα，影響PPARs與C/EBPs之間的協(xié)同作用從而抑制山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化，但KLF16是否直接作用于PPARγ和C/EBPα仍需進一步研究探明。研究指出KLF家族成員之間的表達存在相互影響[40-44]，因此本研究檢測了過表達KLF16后KLFs的表達情況，其中KLF7和KLF15表達上調(diào)，KLF1、3、4、9、8、11～14、17下調(diào)。分析KLFs之間表達相關(guān)性顯示KLF16與KLF1和KLF8的相關(guān)系數(shù)達到0.9以上，存在較強正相關(guān)，與山羊KLF16可能與KLF8具有相互作用的預(yù)測結(jié)果相對應(yīng)，分析發(fā)現(xiàn)KLF8啟動子區(qū)存在KLF16結(jié)合位點，并且本實驗室前期研究表明干擾KLF8抑制山羊肌內(nèi)脂肪細胞成脂分化，KLF16表達水平上調(diào)，基于上述推測山羊KLF16通過拮抗KLF8 抑制PPARα、PPARγ和C/EBPβ的表達來抑制肌內(nèi)脂肪細胞分化。

后續(xù)研究將致力于探究KLF16在山羊不同部位脂肪沉積中的作用，并通過mRNA和蛋白水平的研究全面闡述其調(diào)控脂肪沉積的分子機理。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆獲得具有典型三鋅指結(jié)構(gòu)的山羊KLF16基因序列，主要定位于細胞核，屬于不穩(wěn)定堿性親水蛋白質(zhì)；過表達山羊KLF16減少了脂滴積聚，且可能通過拮抗KLF8下調(diào)脂肪細胞分化標(biāo)志基因PPARγ、PPARα和C/EBPβ的表達水平抑制肌內(nèi)前體脂肪細胞分化；本研究為揭示山羊KLF16調(diào)控肌內(nèi)前體脂肪細胞分化機制提供基礎(chǔ)，并為完善山羊KLFs脂肪細胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建提供數(shù)據(jù)支撐。