一株纖維降解菌的鑒定及其對酒糟固態發酵效果的研究

代秦丹 黎光楊 汪 成 馬 健 胡 瑞 李 翔 姚小鶴 鄒華圍 王之盛 彭全輝 薛 白 王立志

(四川農業大學 動物營養研究所/四川省牛低碳養殖與安全生產高校重點實驗室，成都 611130)

我國擁有非常豐富的低成本粗飼料和非常規飼料資源，這類飼料具有質地粗硬，粗纖維含量高及蛋白質含量低等缺點，在畜牧生產利用中受到限制。一般需要通過合理加工來改善其利用率，例如物理、化學和生物學方法[1]，其中生物學方法對環境友好且具有良好前景[2]。農業部“十三五”規劃也明確提出生物飼料產業發展是供給側結構性改革的重要突破口。因為生物飼料不僅在改善飼料營養價值上發揮作用，也是無抗飼料的重要組成部分。粗飼料經微生物發酵后能提高蛋白質含量[3]，改善氨基酸組成，同時獲得有益的微生物代謝產物[4]。生物發酵飼料應用廣泛，按總量普及率的20%計算，2018年發酵飼料總量約195萬t[5]。

白酒糟在我國產量巨大，據估計2019年我國白酒糟產量可達2 115萬t[6]。由于白酒在釀造的過程中會添加45%左右的稻殼，導致白酒糟木質纖維素含量高，營養價值較低，有機物消化率低[7]，在單胃動物和反芻動物中的實際利用率有限。利用微生物發酵后，酒糟營養價值均有明顯改善[8-9]。利用微生物發酵方式改善白酒糟的營養價值主要集中于降低纖維含量，提高蛋白質含量。能降解纖維的微生物主要包括真菌、細菌和放線菌，其中細菌比真菌有更強的環境耐受性以及功能多樣性，比多數放線菌有更強的纖維酶活[10]，已在飼料、食品和農業等領域發揮作用。目前能在飼料發酵上應用的飼用細菌較少，例如釀酒酵母[11]和枯草芽孢桿菌[12]等，但以上菌種產酶種類有限。因此，為滿足現代工業需求，獲得新的生物催化劑來源，尋找新的環境友好型和高效率的菌種是飼料發酵工業的發展趨勢。

芽孢桿菌類細菌是一類重要的益生菌，飼用芽孢桿菌能生產飼用酶，飼用活性代謝產物以及作為腸道益生菌等，可促進動物生長，提高動物健康，在飼料資源開發應用上有很大的發展空間[13]。芽孢桿菌在自然界廣泛存在，柯恩氏菌屬是其中一種，該屬的成員來自于多種環境中，如土壤、淡水和植物根系等。研究發現某些柯恩氏菌屬于木聚糖[14]、纖維素和半纖維素溶解菌[15]。本實驗室前期從腐殖土中應用平板法分離出一株具有明顯纖維降解效果的細菌，但對其種屬、生理生化特性以及對飼料纖維的降解效果尚不明確。因此，本研究旨在對本實驗室前期篩選的一株纖維降解菌進行鑒定，并以白酒糟為發酵底物，探究其對飼料纖維的降解效率，從而為該菌在低品質高纖維飼料開發與利用方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

1.1.1菌株

本研究所用菌株T5為四川農業大學動物營養研究所草食動物營養研究室前期篩選保藏的菌株。

1.1.2培養基

LB培養基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母浸提物，5.0 g氯化鈉，溶于1 L蒸餾水，121 ℃滅菌30 min，作為種子液培養基。

鑒別培養基：7.5 g羧甲基纖維素鈉，1.0 g KH2PO4，1.0 g蛋白胨，0.5 g酵母膏，0.5 g MgSO4·7H2O，1.5 g NaCl，20.0 g瓊脂，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

發酵培養基：20 g發酵底物(m(麩皮)∶m(濃香型干酒糟)=1∶9，干物質(DM)基礎)，1.5%尿素(以占發酵底物干物質質量分數計算)，置于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。酒糟購于宜賓五糧液酒廠，經65 ℃烘干制成干酒糟，麩皮采自四川農業大學動物營養研究所教學科研基地。

1.2 菌株的活化與鑒定

1.2.1菌株的活化及種子液的確定

取-80 ℃保藏的菌液，于4 ℃解凍后，接種到鑒別培養基上，待長出菌落后，挑取一接種環的菌株接種到含50 mL LB培養基的250 mL錐形瓶中，于39 ℃，180 r/min振蕩培養18 h，作為種子液。此菌液濃度下進行平板計數，其濃度約為3.48×107CFU/mL。

1.2.2菌株的鑒定

在電鏡下進行菌株的形態觀察，部分生理生化指標檢測參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[16]。

利用引物16S rRNA擴增引物(通用引物)正向引物Forward為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物Reverse為：5′-TACGGCTACCTTGTT-ACGACTT-3′進行分子生物學鑒定。提取菌株T5的基因組DNA，以之為模板，用引物擴增其16S rDNA片段，送北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結果進行NCBI-BLAST比對，借助MEGA X軟件構建系統發育樹。

1.3 發酵白酒糟試驗

1.3.1單因素試驗

采用單因素試驗設計對發酵因素進行初步探索和優化，即發酵溫度(30、33、36、39和42 ℃)；發酵時間(2、3、4、5、6和7 d)；種子液添加量(5%、10%、15%、20%、25%和30%)和料水比(1∶1.00、1∶1.25、1∶1.50、1∶1.75、1∶2.00和1∶2.25)，每個處理3個重復。其中添加量為占發酵底物DM質量分數，料水比為料(DM基礎)與水質量比。發酵結束后，65 ℃烘干，粉碎過40目篩，測定粗蛋白質(CP)和中性洗滌纖維(NDF)含量。

1.3.2正交試驗

單因素試驗基礎上，進行四因素三水平的正交試驗設計(L9(34))繼續優化發酵溫度(A)、發酵時間(B)、添加量(C)和料水比(D)，確定最優發酵條件，每個處理3個重復。發酵結束后，65 ℃烘干，粉碎過40目篩，測定NDF和CP含量。

1.3.3最優條件發酵白酒糟

最優條件下發酵白酒糟，比較對照組與發酵組營養成分和酒糟結構的變化，每個處理3個重復。發酵結束后，取約2 g發酵樣品，臨界點干燥后，用電鏡專用膠帶將樣品固定在臺支架上，經干燥噴金處理，利用掃描電鏡(HITACHI Regulus 8100)進行表面結構觀察。剩余樣品于65 ℃烘干，粉碎過40目篩，用于常規營養成分分析。

1.4 體外試驗

1.4.1瘤胃液的采集

瘤胃液于晨飼前2 h，用胃管式瘤胃液采樣裝置抽取3頭1歲左右體況良好的筠連黃牛瘤胃液，將3頭牛的瘤胃液混勻，經4層無菌紗布過濾到充滿CO2的保溫瓶中，并迅速運送回實驗室。筠連黃牛飼養于四川農業大學動物營養研究所試驗基地。

1.4.2體外發酵試驗

參照Menke等[17]方法配制人工唾液，按照祝伊梟等[18]描述的方法進行體外發酵試驗，記錄3、6、9、12、24、48和72 h的發酵管刻度。發酵結束后，用鋁箔集氣袋收集氣體，待測甲烷(CH4)體積分數，然后將發酵管置于冰水中終止發酵，將發酵管中的發酵液用預先恒重的尼龍袋過濾，留下濾渣，用于干物質降解率(IVDMD)的測定。濾液分裝于10 mL無菌離心管中，測發酵液pH，其余-20 ℃保存，用于氨態氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和揮發性脂肪酸(VFA)質量濃度的測定。

1.5 指標測定與計算

干物質(DM)、粗脂肪(EE)和粗灰分(Ash)分別按照GB/T 6435—1986、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007測定，粗蛋白質(CP)、真蛋白(TP)、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的測定參照張麗英的《飼料分析及飼料質量檢測技術》[19]。

按以下公式[20]計算累積產氣量(GP)：

GPt=200×(Vt-V0)/W

(1)

式中：GPt為t時間點的累積產氣量，mL/mg；Vt為樣品發酵t時間后發酵管刻度讀數；V0為樣品在開始發酵時空白培養管刻度讀數；W為樣品干物質質量，mg。

利用氣相色譜儀(CP-3800)法[21]測各揮發性脂肪酸(VFA)質量濃度，總揮發性脂肪酸(TVFA)質量濃度為各VFA質量濃度之和。發酵液pH使用雷磁25型pH酸度計測定。苯酚—次氯酸鹽比色法[22]測定NH3-N質量濃度。參照莊二林[23]的BCA蛋白定量測試盒法測定MCP質量濃度，試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。參照周芯宇等[24]描述的氣相色譜儀(福立GC9790Ⅱ)法測定CH4百分含量，并計算CH4產量，即CH4產量=72 h GP×CH4體積分數。IVDMD%=100×((尼龍袋重+樣重)-過濾后的尼龍袋和濾渣重)/樣重。

1.6 數據統計與分析

試驗數據經Excel整理后，用GraphPad Prism 8.0繪制單因素試驗結果和產氣量變化圖，并用SPSS 20.0進行二次回歸統計分析；對正交試驗結果進行極差和方差分析；發酵前后酒糟營養成分和瘤胃發酵特性結果進行One-way ANOVA分析，結果用平均值±均值標準誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1形態學及部分生理生化鑒定

從圖1掃描電鏡下可以觀察到菌株呈桿狀，由表1可知，菌株革蘭氏染色和甲基紅試驗呈陽性，不能分解淀粉，但可降解纖維二糖、葡萄糖和蔗糖，屬兼性厭氧菌。此結果表明菌株T5為革蘭氏陽性桿菌，能利用葡萄糖生成有機酸。

圖1 掃描電鏡下菌株T5的形態結構Fig.1 Morphological structure of the strain T5 by scanning electron microscope

表1 菌株T5的部分生理生化特征Table 1 Some physiological and biochemical characteristics of strain T5

2.1.2菌株T5的系統發育樹

測序后，應用NCBI-BLAST在線分析工具對測序結果進行相似性比對，建立的系統發育樹如圖2所示，菌株T5與Cohnellaxylanilytica聚為一支，他們的親緣關系最近，且BLAST分析中菌株T5與Cohnellaxylanilytica的16S rRNA序列的相似性最高，達99.57%。以上結果表明該菌株為Cohnellaxylanilytica，可命名為Cohnellaxylanilyticastrain T5。

線段0.005表示序列差異的分支長度，括號內數字為GenBank登錄號。Line segment 0.005 represents the branch length of sequence difference, and the number in parentheses is the GenBank login number.圖2 菌株T5的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain T5

2.2 單因素發酵條件的優化

如圖3所示，隨著溫度、時間、添加量和料水比因素的梯度變化，NDF和CP含量也隨之變化。如表2所示，當發酵溫度分別為36.26和35.99 ℃，發酵時間分別為4.92和5.28 d，添加量分別為19.08%和17.33%，含水量分別為59.25%和56.86%(料水比在1∶1.25～1∶1.50)時，NDF和CP增長率分別達到最優值。回歸分析最適值結合圖3中各因素的NDF和CP增長率的變化趨勢可以確定菌株T5進行正交試驗的各因素水平：發酵溫度分別為30、33和36 ℃，發酵時間分別為4、5和6 d，添加量分別為15%、20%和25%，料水比分別為1∶1.25、1∶1.50和1∶1.75。

圖中左縱坐標表示NDF和CP質量分數的變化范圍，右縱坐標代表NDF和CP增長率的變化范圍。The left longitudinal coordinate in the figure represents the change range of NDF and CP mass fraction, and the right longitudinal coordinate represents the change range of NDF and CP growth rate.圖3 菌株T5發酵酒糟單因素試驗分析Fig.3 Single factor test analysis of strain T5 fermented distillers’ grains

表2 菌株T5發酵酒糟單因素試驗的回歸分析Table 2 Regression analysis of single factor test for strain T5 fermented distillers’ grains

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test

2.3 正交試驗

表4 菌株T5正交試驗結果的極差分析表Table 4 Table of extreme differential analysis of the results of the orthogonal tests for strain T5

表5 菌株T5正交試驗結果的方差分析表Table 5 Analysis of variance of strain T5 orthogonal test results

2.4 發酵酒糟前后營養成分變化

由表6可知，對照組和T5發酵組的CP、TP、CF、NDF、ADF和Ash質量分數差異顯著(P<0.05)，而EE質量分數差異不顯著(P>0.05)。T5發酵組CP和TP質量分數相對于對照組分別增加了19.68%和30.38%；Ash質量分數由8.90%增加到9.25%；而EE、CF、NDF和ADF相對于對照組都有不同程度的降低。其中NDF、ADF和CF質量分數分別降低了31.68%、27.69%和7.95%，EE質量分數由13.70%降低到12.66%。此結果表明，與對照組相比，發酵酒糟組的纖維含量有較大幅度降低，并且蛋白含量有所增加。

表6 發酵酒糟前后營養成分變化(DM基礎)Table 6 The changes of nutrient composition before and after fermentation of distillers’ grains (DM basis)

2.5 發酵前后掃描電鏡對比

由圖4掃描電鏡結果可知，對照組的掃描電鏡結果顯示酒糟的結構比較完整，而T5發酵組的酒糟結構松散不完整，表面出現大量蜂窩狀孔洞(剪頭指向)，并有明顯的菌株附著(圓內)。此結果表明，與對照組相比，菌株T5發酵酒糟可破壞酒糟結構。

(a)和(b)為對照組，(c)和(d)為T5發酵組。(a) and (b) represent control group, (c) and (d) represent T5 fermentation group.圖4 發酵前后酒糟的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrographs of before and after fermentation

2.6 酒糟發酵前后的瘤胃發酵特性

由圖5和表7可知，對照組的GP在12～72 h時間段均高于T5發酵組，且72 h GP有顯著高于T5發酵組的趨勢(P=0.06)。此外，T5發酵組的NH3-N、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸質量濃度以及IVDMD均顯著高于對照組(P<0.05)，但MCP質量濃度和乙酸/丙酸差異不顯著(P>0.05)。而對照組的CH4百分含量和產量顯著高于T5發酵組(P<0.05)。這表明，與對照組相比，發酵酒糟組的產氣量和CH4產量降低，而VFA、TVFA和NH3-N質量濃度均有不同程度的升高。

圖5 對照組和T5發酵組的累積產氣量動態變化比較Fig.5 Comparison of dynamic changes of cumulative gas production in control group and T5 fermentation group

表7 菌株T5發酵酒糟前后體外發酵參數的變化Table 7 Changes of in vitro fermentation parameters of before and after fermentation of distiller’s grains

3 討 論

3.1 菌株T5的鑒定及發酵白酒糟的工藝條件優化

根據菌株16S rRNA測序結果可以發現菌株T5隸屬于柯恩氏菌屬，與Cohnellaxylanilytica的相似性最高。Khianngam等[25]研究發現一株Cohnellaxylanilytica具有降解纖維作用，這與本研究結果一致。該菌屬兼性厭氧菌，在發酵工程中能較好的適應有氧發酵和厭氧發酵，一定程度上可為進一步開發工程菌株提供菌源。

本研究所用種子液是根據菌株生長曲線確定，將菌接種到LB培養基，培養至菌株生長到對數期剛結束時，此時菌株生長速度和產酶活性達最高[26-27]。固態發酵通常以營養均衡的發酵底物為基礎，加入益生菌和水，在適宜溫度的好氧或厭氧環境下發酵[28]。本研究考慮到白酒糟營養價值較低，所以發酵培養基中添加麩皮，為微生物生長產酶提供碳源。由于酒糟酸度高，pH一般在3.51～4.56，培養基添加尿素，可以達到調節pH，增加氮源的目的。此外對于粗飼料而言，還可以起到氨化的作用。例如張玉誠[29]在發酵酒糟時，添加了一定比例的麩皮、玉米粉和菜籽粕以及1.5%尿素；張博潤等[30]添加了麥芽根粉和2%尿素。

為達到更好的發酵效率，有必要優化發酵過程，促進飼料中各種營養物質的生物轉化[31]。本研究對發酵效果影響最大的因素是溫度和料水比，其次是種子液和接種量，影響最小的是發酵時間。溫度除了影響菌株的生長繁殖外，還會影響其酶活。Pisa等[32]研究發現一株Cohnellasp. AR92的最適生長溫度為37 ℃，Huang等[33]發現一株Cohnellananjingensissp. nov.的最適培養溫度為30 ℃。本研究菌株T5的最適發酵溫度為33 ℃，在前人研究范圍內。發酵環境中的水分直接影響菌株的生存環境和活性，從而影響菌株產酶效果[34]。Li等[11]研究表明粗糙脈孢菌單菌發酵豆粕和粗糙脈孢菌和釀酒酵母混菌發酵的最大影響因素之一就是料水比。此外,于海漫[35]用單菌發酵白酒糟，物料含水量在60%最適，這與本研究結果一致。種子液添加量也是影響發酵的重要因素，添加量過低，菌株繁殖緩慢，且易受雜菌污染，添加量過多，則會縮短菌株的生長周期，且大量菌株代謝產物聚集，會影響菌株活性物質的形成[36]。

3.2 菌株T5對白酒糟纖維的降解效果

酒糟是一類特殊的非常規飼料資源，其非淀粉多糖(NSP)含量高，并且還含有殘留的酵母細胞和酵母細胞成分、活性生長因子和未知生長因子等[37]。NSP是飼料纖維的主要成分，能將營養物質包裹起來，妨礙動物消化吸收。如將這些NSP去除，營養物質就能從細胞壁里釋放出來，從而提高碳水化合物利用率。本研究結果發現，發酵后酒糟的纖維含量顯著降低，并且掃描電鏡結果展示酒糟結構被破壞，說明菌株T5在纖維降解上發揮作用，且從營養學角度上說，這有利于家畜消化吸收。發酵底物在尿素氨化和滅菌作用下，纖維結構之間的氫鍵被打斷，暴露出結晶纖維素內核，把纖維素從木質素的包裹中釋放出來，增加發酵培養基之間的孔隙度以及纖維素和微生物的接觸面積，利于纖維降解[38]。發酵過程中纖維被降解，轉化為單糖和二糖，并伴隨著水和二氧化碳的產生，有機物的比例相對降低，而微生物難利用的無機物相對增加，表現為發酵酒糟Ash含量增加。值得關注的是，本研究發酵酒糟CP和TP含量也明顯升高，可能原因是纖維含量降低，相對升高了蛋白含量，同時菌株T5可能利用尿素氮源用于自身生長，并生成微生物蛋白，此外菌株T5菌體本身也含有蛋白質組分。與本課題組前期混菌發酵白酒糟NDF含量降低了18.12個百分點[29]相比，本研究NDF降解效果與之相似，可能是因為本研究發酵培養基經過滅菌以及在最適的物理條件下進行的發酵。劉鵬[39]利用酶菌混合固態發酵白酒糟，CF降幅為42%。宋善丹等[40]混菌固態發酵白酒糟，NDF降幅25.53%，CP增率22.32%。與以上研究相比，本研究菌株T5單菌發酵白酒糟，可達到降解纖維含量，改善蛋白含量的目的。

3.3 體外產氣法評定發酵白酒糟的瘤胃發酵特性

不同類型飼料作為發酵底物，體外發酵產氣特性會有一定差異。GP某種程度上反映瘤胃微生物的降解活性和飼料降解率[41]。T5發酵組表現出較低GP，可能是因為T5發酵組中酒糟CP含量相對較高的原因，因為瘤胃產氣主要基于碳水化合物的降解，而飼料蛋白對GP貢獻不大。由于對照組還保留較多的難降解碳水化合物以及較低的CP含量，所以GP較高。飼糧營養組成是影響CH4產生的重要因素，一般低質的粗飼料CH4產量大[42]。瘤胃微生物利用碳水化合物生成CO2和H2，然后經甲烷菌還原生成CH4[43]。對照組的CH4產量更高，一是因為其可能更有助于甲烷菌的生長[44]，二是因為對照組纖維含量高，有助于瘤胃纖維降解菌的附著，纖維降解菌活性增強，產生更多的H2和CO2供甲烷菌利用。這也表明經菌株T5發酵的酒糟飼喂反芻動物，可能達到一定的減排作用。瘤胃NH3-N濃度能反映瘤胃氮代謝，也能間接反映瘤胃微生物分解飼料CP產生NH3-N和利用NH3-N合成MCP的平衡情況[45]。因為酒糟發酵過程中添加了尿素，再加上體外發酵過程中產生的NH3-N不能經瘤胃上皮吸收，所以試驗結果中的NH3-N質量濃度高于正常范圍值[46]。本研究MCP質量濃度差異不顯著，而T5發酵組的NH3-N質量濃度高于對照組，說明經菌株T5發酵后的酒糟蛋白質可能更容易被瘤胃微生物利用分解成NH3-N。此外研究發現發酵組的IVDMD顯著高于對照組，這可能是因為酒糟經發酵后，非結構性碳水化合物和可消化有機物含量增加，也可能與對照組相比，發酵組的碳氮比更適于瘤胃微生物的利用。

VFA是維持反芻動物生長和生產的主要能量來源，能提供反芻動物能量需要的70%～80%，其中乙酸、丙酸和丁酸約占瘤胃發酵產生TVFA的95%左右[42]。本課題組前期探索了不同酒糟的瘤胃發酵特性，發現不同酒糟NDF含量與乙酸含量呈負相關，與丙酸含量呈正相關[47]。Gastelen等[48]報道，高淀粉含量傾向于丙酸的生成，低淀粉含量傾向于乙酸的生成。研究表明目前還沒有確切的經驗模型或化學計量模型對瘤胃VFA產量和比例進行準確的預測[49]。一般而言，經白酒釀造后，白酒糟的淀粉含量低，但本研究發酵組的各VFA和TVFA質量濃度均高于對照組。分析其原因可能是對照組由于含有較高比例的致密性結構碳水化合物，導致瘤胃纖維降解菌不能充分利用，而發酵酒糟經微生物作用后，木質纖維降解成可利用的碳水化合物，可消化養分增加，因此表現為各VFA含量均有所升高。此外菌株的甲基紅試驗呈陽性，證明菌株能利用葡萄糖產生甲酸、乙酸和乳酸等有機酸。在烘干過程中會有部分揮發，但培養基中仍會有部分有機酸殘留，這也是VFA質量濃度均升高的原因之一。

4 結 論

經鑒定菌株T5為Cohnellaxylanilytica，其在最佳工藝條件下發酵酒糟，可以破壞酒糟的結構，降解纖維含量，提高蛋白含量。初步評定該發酵酒糟在反芻動物上應用具有減少甲烷能損失，改善能量供應和營養物質利用率的作用。因此菌株T5具有改善白酒糟營養價值的效果，一定程度上可作為飼料資源開發的候選菌株。