高效液相色譜法測定蛋白粉中維生素E含量的 不確定度評定

薛紅瑋，羅偉敏，沈 棚

（1.上海營家生物科技有限公司，上海 201703；2.營家健康科技（廣東）有限公司，廣東東莞 523808； 3.上海康諾執信食品有限公司，上海 201703）

本試驗選用的功能型蛋白粉是一種具有增強免疫力作用的保健食品，主要在原有蛋白質組分的基礎上增加了維生素、膳食纖維等功能型原料，以提升蛋白粉的綜合功效。功能型蛋白粉的主要成分為蛋白質，特別添加了維生素E。蛋白質是構成和修復組織的主要原料，身體的生長發育、衰老組織的更新、疾病和造成創傷后組織細胞的修復，都離不開蛋白質[1]。因此，人體需每天攝入一定量的蛋白質作為構成和修復組織的最重要的材料[2]。維生素E是主要的脂溶性抗氧化物，可阻止大分子發生氧自由基損傷，從而避免很多癌癥的發生；維生素E可阻止氧化低密度脂蛋白的形成，從而防止動脈粥樣硬化和心血管疾病的發生[3]；維生素E還可清除腦組織等細胞的脂褐質并改善皮膚彈性，改善記憶力。將維生素E添加到蛋白粉中，可提高蛋白粉增強免疫力的功效。維生素E作為功能型蛋白粉的主要功效成分，其有效成分的含量對產品質量的評定非常重要[4]。

測量不確定度是與測量結果相關聯的參數，表征了可以合理地賦予被測量的量值分散程度[5]。通常由實驗室測試得到的單個檢測結果并不能代表樣品中目標物質的真實含量，需用測量不確定度評估真值分布的范圍。為準確地表達出樣品中目標物質的含量，本試驗通過分析測試過程，找出各不確定度分量，建立一套合理、完整的評定方案，得到更精確的表達測定結果[6-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能型蛋白粉，營家健康科技（廣東）有限公司；無水乙醇（分析純）；抗壞血酸（分析純）；氫氧化鉀（分析純）；石油醚（分析純）；無水硫酸鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；2,6-二叔丁基對甲酚（分析純）；維生素E標準品（α-生育酚，純度99.5%）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配紫外檢測器，安捷倫科技）；752G型紫外可見分光光度計（上海儀電分析設備有限公司）；AUW 120D分析天平[島津（中國）有限公司]；JA1004電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；SHA-B恒溫水浴振蕩器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LC-RE-201D旋轉蒸發儀（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

（1）皂化。稱取2 g（精確至0.01 g）蛋白粉試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入20 mL溫水，再加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT（2,6-二叔丁基對甲酚），加入30 mL無水乙醇，加入10 mL氫氧化鉀溶液（50%），邊加邊振搖，混勻后80 ℃恒溫水浴振蕩皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至 室溫。

（2）提取。將皂化液用30 mL水轉入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振蕩萃取5 min，將下層轉移至另一個250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚再次萃取，合并醚層。

（3）洗滌。用約100 mL水洗滌醚層，約重復3次，直至將醚層洗至中性（用pH試紙檢測下層溶液pH值），去除下層水相。

（4）濃縮。將洗滌后的醚層轉移至250 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至近干，用甲醇分次將蒸發瓶中殘留物轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度。溶液過0.22 μm有機系濾膜后供液相色譜測定。

1.3.2 標準溶液配制

（1）標準儲備溶液。準確稱取維生素E標準品（α-生育酚）50.0 mg，用無水乙醇溶解后，轉移至50 mL容量瓶，定容至刻度，溶液的濃度約為1.00 mg/mL，制得標準儲備溶液。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20 ℃下避光保存，有效期6個月。臨用前將溶液回溫至20 ℃，并進行濃度校正。濃度校正方法為取維生素E（α-生育酚）標準儲備溶液 500 μL于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，混勻，分別用1 cm石英比色皿，以無水乙醇為空白參比，在292 nm處測定吸光度值。

（2）標準中間溶液。準確吸取維生素E（α-生育酚）標準儲備溶液5.00 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到100 μg/mL的標準中間溶液。在-20 ℃下避光保存，有效期半個月。

（3）標準系列工作液。準確吸取維生素E（α-生育酚）標準中間溶液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到標準系列工作液，其中維生素E（α-生育酚）的濃度分別為5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、 20.0 μg/mL、40.0 μg/mL和60.0 μg/mL，現用現配。

1.3.3 液相色譜儀器條件

色譜柱：Agilent C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 柱 溫：25 ℃；流 動 相：100%甲 醇；流 速： 0.8 mL/min；檢測波長為：294 nm；進樣量：10 μL。

1.3.4 建立數學模型

試樣中的維生素E（α-生育酚）的含量計算公式如下：

式中：X為試樣中維生素E的含量，mg/100 g；c為根據標準曲線計算得到的試樣中維生素E的濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；f為換算因子，為 0.001；100為試樣中的量以100 g計算的換算系數；m為試樣的稱樣量，g。

1.3.5 不確定度來源分析

參照試驗方法及數學模型，影響檢測結果的不確定度來源主要有測量重復性、標準溶液配制過程、樣品稱量、試樣定容及加標回收率等。

2 結果與分析

2.1 不確定度分量的評定

2.1.1 測量結果重復性引入的不確定度u0

在相同的條件下，對試樣進行10次獨立測定，結果如表1所示。測量結果重復性引入的不確定度屬于A類不確定度，可用10次重復測定的標準偏差表示，即單次測定引入的標準不確定度為。因此，測 量結果重復性引入的的相對標準不確定度為

表1 蛋白粉中維生素E的測定結果

2.1.2 標準溶液配制過程引入的不確定度u1

（1）標準物質純度引入的標準不確定度u1(1)。標準物質證書顯示，標準物質純度為99%，擴展不確定度為U為0.5%，k=2，標準物質純度引入的標準不確定度為，相對標準不確定度為

（2）標準物質稱量引入的標準不確定度u1(2)。標準物質稱量采用十萬分之一天平，稱量50.2 mg維生素E標準物質，分析天平的檢定證書顯示最大允許誤差為0.5 mg，為均勻分布，取k=3，標準物質稱量引入的不確定度，相對標準不確定度

（3）儲備液定容過程中引入的標準不確定度u1(3)。儲備液配制過程中的不確定度主要來源于容量瓶的容量允差、溫度校正及濃度校正。儲備溶液定容用到50 mL的A級容量瓶，在20 ℃下容量允差為±0.05 mL，假設為三角分布，取k為，定容體積引入的標準不確定度。實驗室溫度控制在（20±5）℃下，水的膨脹系數為2.1×10-4mL/℃，假設為矩形分布，取k為，溫度校正引入的標準不確定度則定容引入的標準不確定度為u1(3)=。相對標準不確定度

（4）濃度校正引入的不確定度u1(4)。同一樣品用紫外分光光度計測定10次，結果見表2。則濃度校正引入的不確定度可用標準偏差代替。標準儲備液重復校正引入的不確定度屬于A類不確定度，可用10次校正的標準偏差表示，即單次測定測定的，則標準不確定度，相對標準不確定度為

表2 重復校正10次得到的儲備液濃度

（5）標準系列液配制過程引入的不確定度u1(5)。標準系列液配制過程中的不確定度主要來源于容量瓶的容量允差、溫度校正。標準溶液的配制過程用到50 mL容量瓶2次，5 mL的分度吸量管3次，10 mL容 量 瓶7次，0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和10.0 mL的分度吸量管各1次。《玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）中在溫度為20 ℃下不同規格的玻璃量器容量允差及包含因子見表3。假設為三角分布，取k為，體積引入的標準不確定度計算得到的各相對標準不確定度如表3所示。容量工具引入的合成相對標準不確定度為： 實驗室的溫度控制在（20±5）℃，水的膨脹系數為2.1×10-4mL/℃，假設為矩形分布，取k為，使用以上容量工具由溫度校正引入的相對標準不確定度，標準系 列液配制過程引入的相對標準不確定度u1rel(5)=

表3 不同玻璃量器的容量允差

因此，標準物質引入的相對合成標準不確定度u1rel=

2.1.3 樣品稱量引入的不確定度u2

用百分之一天平分別稱量5.00 g和5.03 g兩個平行樣，天平的檢定證書給出的最大允許誤差為0.05 g，屬于均勻分布，取k=，樣品稱量引入的標準不確定度，平均稱樣量，則樣品稱量引入的相對標準不確定度為

2.1.4 試樣定容引入的不確定度u3

樣品經皂化、提取、洗滌和濃縮后轉移至 10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，此過程的不確定度主要由容量瓶的容量允差、溫度校正引入。定容用到的10 mL容量瓶為A級，在20 ℃ 下校正得到的容量允差為±0.02 mL，假設為三角分布，取k=，則實驗室溫度控制在（20±5）℃下，有機溶劑的膨脹系數為1.0×10-4mL/℃，假設為矩形分布，取k為，溫度校正引入的標準不確定 度。因此，試 樣定容引入的不確定度為0.00867 mL，相對標準不確定度為u3rel=

2.1.5 樣品前處理加標回收率引入的不確定度u4

樣品的前處理過程煩瑣，包含試樣制備、皂化、提取、洗滌和濃縮，不確定度難以評定，可通過加標回收試驗進行評定，本試驗對同一樣品進行6次獨立的加標回收率測試，試驗結果見表4，樣品加標回收率的相對標準不確定度

表4 蛋白粉6次獨立加標回收率試驗結果

2.2 合成不確定度的計算

綜上所述，高效液相色譜法測定功能型蛋白粉中的維生素E含量的相對標準不確定度由測量重復性不確定度、標準溶液引入的不確定度、樣品稱量引入的不確定度、樣品定容和樣品的前處理過程引入的不確定度5個主要不確定度分量組成。合成相對標準不確定度：

蛋白粉中維生素E的平均含量為8.22 mg/100 g， 因此合成標準不確定度為u=8.22×0.013 2= 0.109 mg/100 g。

2.3 擴展不確定度

本試驗的測量結果符合正態分布，取置信概率P=95%，置信因子k=2，則擴展不確定度為U=u×k=0.109×2≈0.22 mg/100 g，蛋白粉中維生素E結果表述為（8.22±0.22） mg/100 g，k=2。

3 結語

本文對高效液相色譜法測定功能型蛋白粉中維生素E含量的不確定度進行了分析評定，研究表明影響檢測結果不確定度的因素主要包括測量重復性、標準溶液的配制過程、樣品稱量、樣品定容和前處理過程。其中，標準溶液的配制過程對結果的不確定度影響最大。因此，在測定過程中應選用證書齊全的標準物質，配制過程中使用的器皿應經過檢定校準，嚴格遵守標準溶液配制操作規程，減少測定過程的不確定度，提高檢測的準確度。