異源表達菊芋HtHCT基因對受體植物木質素相關生理生化指標的影響

張新業，蘇彥蘋，朱 姝，王聰艷,2，侯曉強，李文靜

(1. 廊坊師范學院 生命科學學院,河北廊坊 065000; 2. 河北省動物多樣性重點實驗室,河北廊坊 065000; 3. 廊坊市細胞工程與應用研究重點實驗室,河北廊坊 065000)

木質素是植物體內重要的大分子高聚物，含量僅次于纖維素，是維管植物細胞壁的重要成分。木質素是植物由水生向陸生進化的重要標志，在支撐植物體，保持細胞內的水分，長距離運輸水分和營養物質及抵御干旱、病原微生物等方面具有重要的生物學功能[1-4]。然而，木質素的存在卻不利于植物資源的利用。在造紙工業中，紙漿內木質素的去除，不僅高能耗、高成本，而且污染環境。木質素含量過高還會影響牲畜對飼草植物的消化及木質纖維生產燃料乙醇的效率。因此，植物資源木質素含量的改良越來越受到重視[3,5]。

木質素通常由3種木質素單體—對羥基苯基木質素(H型木質素)、愈創木基木質素(G型木質素)和紫丁香基木質素(S型木質素)氧化聚合而成[6]。羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶(HCT)是一種酰基轉移酶，其以香豆酰輔酶A(p-coumaroyl CoA)為底物，將苯丙烷代謝引入木質素單體的合成[7]。到目前為止，已有多個物種內的HCT基因被鑒定，HCT基因在植物體內多以基因家族的形式出現，其蛋白結構中通常含有保守基序HXXXD和DFGWG[4,8-10]。由于物種的不同，HCT基因家族成員數目會有所差異。如Ma等[9]從蘋果(Malus×domestica)、桃(Prunuspersica)、草莓(Fragariavesca)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和梨(Pyrusbretschneideri)基因組中分別鑒定到90、60、72、50和82個HCT基因。茄科植物的HCT基因數目較少，煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)和辣椒(Capsicumannuum)中分別存在4、2和6個HCT基因[4]。最近，Chao等[11]從毛果楊(Populustrichocarpa)中鑒定到10個HCT基因家族成員。功能研究表明，HCT基因能夠參與并調節木質素的合成，其下調表達能夠顯著降低木質素含量并改變木質素單體的組成[9]。

菊芋(Helianthustuberosus)是菊科、向日葵屬的一種多年生草本植物，又名洋姜、鬼子姜。菊芋抗鹽堿、抗旱、抗寒能力較強，且具有較好的防風固沙作用[12]。目前關于菊芋的研究主要集中在種質資源收集評價、生物能源開發、飼草營養品質、抗逆生理及糖類代謝等方面[13-14]，而關于菊芋木質素代謝相關基因的研究鮮見報道。此外，菊芋中木質素含量較高，亦不利于其在造紙、飼料及生物能源等領域的應用[15-17]。廊坊師范學院植物分子遺傳學研究室前期從菊芋品種‘廊芋8號’中克隆了HCT基因—HtHCT，其開放閱讀框(open reading frame,ORF)長 1 293 bp，編碼430個氨基酸，HtHCT在菊芋莖中的表達量顯著高于其他被測組織，且能響應干旱、鹽脅迫處理[18]。本試驗構建HtHCT基因的植物表達載體，并對擬南芥和本氏煙(Nicotianabenthamiana)進行遺傳轉化，初步研究其對木質素及類黃酮合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(Col)種子經5%的次氯酸鈉溶液消毒后，接種到MS培養基上，4 ℃春化48 h，置于人工氣候室中(22 ℃、光照16 h/黑暗8 h、光照強度80 μmol·m-2·s-1)萌發生長。選取萌發后7～10 d的健壯幼苗，移栽到營養土中 [V(泥炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=2∶7∶1]，繼續培養，條件同上。

本氏煙種子經5%的次氯酸鈉溶液消毒后，接種到MS培養基上，置于人工氣候室中(23 ℃、光照16 h/黑暗8 h、光照強度70 μmol·m-2·s-1)萌發生長，待長出2～3片葉后，將幼苗移至培養瓶中，并在同一條件下繼續培養。

含HtHCT基因CDS序列的原核表達載體pET-28a-cHtHCT及植物表達載體pCAMBIA1390(含CaMV 35S啟動子、卡那霉素抗性、潮霉素篩選標記)均由廊坊市細胞工程與應用研究重點實驗室保存。

1.2 植物表達載體的構建

以原核表達載體pET-28a-cHtHCT為模板，利用含有酶切位點PstⅠ、EcoRⅠ的引物對HCT4F/HCT4R進行PCR擴增，利用限制性內切酶[寶生物工程(大連)有限公司]對PCR擴增產物和植物表達載體pCAMBIA1390分別進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京莊盟科技有限公司)回收純化目的基因片段和pCAMBIA1390載體骨架，二者經Ligation high(日本TOYOBO公司)連接后，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans 10感受態細胞，經雙酶切鑒定后送出測序，獲得重組植物表達載體pCAMBIA1390-HtHCT。

1.3 植物遺傳轉化及轉基因植株鑒定

將植物表達載體pCAMBIA1390-HtHCT導入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態細胞GV3101中，經菌落PCR鑒定后，陽性克隆用于遺傳轉化。利用蘸花法[19]轉化擬南芥(Col)，收獲T0代種子。T0代種子經消毒后，點播到1/2MS培養基上(含30 μg·mL-1潮霉素)，進行抗性篩選，提取抗性苗基因組DNA進行PCR鑒定，得到的陽性苗進一步提取RNA，并進行RT-PCR檢測(表1)，收獲T1代陽性植株的種子。T1代種子繼續使用潮霉素抗性平板篩選，抗性苗移栽到營養土中，利用PCR進行進一步鑒定，獲得T2代陽性植株，長至開花期后，將T2代陽性植株按T1代來源混收莖稈，用于生理生化指標測定。

用手術刀將生長至4～5周的本氏煙無菌苗葉片切成小塊，利用葉盤法[20]進行遺傳轉化，提取T0代植株DNA，進行PCR檢測，獲得的陽性苗進一步利用RT-PCR鑒定(表1)，陽性植株自交收種。將T0代種子按株系點播于營養土中，長至3～4葉時，提取葉片DNA，進行PCR鑒定，剔除陰性苗，保留T1代陽性植株，將生長約7～8周的T1代陽性植株按T0代來源混收莖稈，用于生理生化指標測定。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.4 轉基因植株生理生化指標測定

將上述混收的植物材料105 ℃殺青15 min，70 ℃烘干至恒量，粉碎后過80目篩，用于以下性狀的測定(江蘇三黍生物科技有限公司)。

1.4.1 總木質素含量測定 采用乙酰溴法[23]測定總木質素含量。稱取50 mg樣品，加入1 mL 70 %的乙醇，10 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；加入1 mL氯仿/甲醇(1∶1)溶液重懸沉淀，離心后棄上清液；加入1 mL丙酮混勻，干燥后再加入1.5 mL 0.1 mol·L-1pH 5.0的醋酸鈉緩沖液，80 ℃加熱20 min；加入10 μL 0.01 %的疊氮化鈉、10 μL 0.1 mg·mL-1淀粉酶和10 μL 1.10～1.30 g·mL-1普魯蘭酶，37 ℃過夜；加熱至100 ℃終止反應，離心棄上清液，加水清洗沉淀；加入1 mL丙酮，混勻并干燥丙酮。稱取約1 mg上述沉淀，加入100 μL乙酰溴(25%)溶液，50 ℃加熱3 h；然后加入400 μL 2 mol·L-1氫氧化鈉和70 μL 0.5 mol·L-1鹽酸羥胺，混勻后，用乙酸定容至2 mL，取200 μL于280 nm波長下測定吸光值。總木質素含量計算公式為：總木質素含量(μg·mg-1)=[ΔOD280/(C×L)]×(V/m)×100%×10，其中C為吸光系數15.69，L為光程0.539 cm，V為反應體積2 mL，m為樣品質量。

1.4.2 木質素單體含量測定 稱取10 mg樣品，加入500 μL硫解液(2.5%三氟化硼、10%乙硫醇、87.5%二氧六環)；100 ℃加熱4 h；加入300 μL 0.4 mol·L-1碳酸氫鈉，混勻后加入0.2 mL水和0.3 mL乙酸乙酯；14 000 r·min-1離心10 min，取上清液；干燥后加入150 μL吡啶(含內標反式肉桂酸)和50 μL三甲基硅烷，60 ℃反應1 h后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液利用Agilent7820A-5977B氣質聯用儀[24]進行測定。

1.4.3 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉-氯化鋁法測定總黃酮含量[25]。稱取50 mg樣品于2 mL離心管中，加入1 mL甲醇，60 ℃抽提4 h。取50 μL提取物，加入950 μL甲醇和4 mL水，再加入300 μL 5%亞硝酸鈉溶液，室溫靜置5 min。加入300 μL 10%氯化鋁溶液，靜置6 min。加入2 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉，最后定容到10 mL，靜置15 min。于510 nm處測定吸光值。類黃酮含量測定公式：類黃酮含量=C×V/M，其中C為根據標準曲線計算出的結果，V為提取液總體積，M為樣品質量。

以蘆丁為標樣制作標準曲線。稱取蘆丁 1 mg，加入甲醇配制成濃度為0.1 mg·mL-1、 0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1 mg·mL-1的標準溶液，測定方法同上。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體構建

以引物對HCT4F/HCT4R擴增質粒pET-28a-cHtHCT，得到長約1 300 bp的HtHCT基因片段，經PstⅠ、EcoRⅠ雙酶切后連入經相同內切酶酶切的pCAMBIA1390，轉化大腸桿菌后，陽性克隆抽提質粒，經雙酶切后得到長度一致的目的基因片段(圖1)，酶切鑒定無誤后送公司測序，從而獲得重組表達載體pCAMBIA1390-HtHCT。

A. HtHCT基因片段的PCR擴增; M.DL2000; 1～2. HtHCT基因片段; B. 植物表達載體pCAMBIA1390-HtHCT構建示意圖; C. 植物表達載體pCAMBIA1390-HtHCT的雙酶切鑒定; M. DL5000; 1. pCAMBIA1390-HtHCT; 2. PstⅠ/EcoRⅠ的雙酶切產物

2.2 植物遺傳轉化及轉基因植株鑒定

分別利用蘸花法和葉盤法對擬南芥和本氏煙進行遺傳轉化，并獲得轉基因材料(圖2)。以重組質粒pCAMBIA1390-HtHCT和野生型材料分別作為陽性和陰性對照，利用引物對HCT4F/HCT4R對擬南芥T1代抗性植株和本氏煙T0代抗性植株進行PCR檢測。結果表明，陽性對照和轉化成功的陽性植株均擴增出長約1 300 bp的目的片段，說明HtHCT基因已整合到受體材料的基因組中，而陰性對照和未轉化成功的材料則沒有相應的擴增產物(圖3-A、C)。

A～E. 擬南芥轉化流程; A. 種子萌發; B. 幼苗移栽; C. 花序侵染; D. 轉基因植株生長發育; E. 種子采集; F～J. 本氏煙轉化流程; F. 侵染后共培養; G. 愈傷誘導; H. 愈傷篩選及幼苗分化; I. 幼苗生根; J. 幼苗移栽

分別以擬南芥Actin基因和本氏煙60Sribosomalprotein基因作為內參，利用引物對AtActin2sqF/AtActin2sqR和NbL23qF/NbL23qR對經PCR檢測呈陽性的T1代轉基因擬南芥和T0代轉基因本氏煙進行RT-PCR檢測。結果表明，野生型擬南芥和本氏煙中均無擴增產物，而經PCR鑒定為陽性的植株均擴增出特異性片段，說明HtHCT基因已成功轉錄(圖3-B、D)。

A. T1代轉基因擬南芥的PCR檢測; M. DL2000; 1. 重組質粒pCAMBIA1390-HtHCT; 2. 野生型; 3～8. 轉基因擬南芥植株; B. T1代轉基因擬南芥的RT-PCR檢測; W. 野生型; 4,5,8. 轉基因擬南芥植株; C. T0代轉基因本氏煙的PCR檢測; M. DL2000; 1. 重組質粒pCAMBIA1390-HtHCT; 2. 野生型; 3～9. 轉基因本氏煙植株; D. T0代轉基因本氏煙的RT-PCR檢測; W. 野生型; 3,7,8,9. 轉基因本氏煙植株

2.3 轉基因材料生理生化指標測定

2.3.1 轉基因材料總木質素含量測定 將載體pCAMBIA1390-HtHCT轉入擬南芥和本氏煙中，分別測定野生型和轉基因株系的總木質素 含量。

在擬南芥中，轉基因株系AtL4和AtL5的總木質素含量高于野生型，其中株系AtL5與野生型之間差異極顯著。而轉基因株系AtL8的總木質素含量則極顯著低于野生型。在本氏煙中，轉基因株系NbL3和NbL7的總木質素含量極顯著地高于野生型，株系NbL9的含量則低于野生型(表2)。以上結果表明，HtHCT基因能夠影響木質素的合成。

2.3.2 轉基因材料木質素單體含量測定 木質素單體含量的測定結果表明，擬南芥和本氏煙中的木質素單體均以G型木質素和S型木質素為主，而H型木質素含量最低。在擬南芥中，HtHCT基因的導入對G型木質素含量的影響最大，S型木質素次之，而對H型木質素含量的影響最小。在本氏煙中，僅有轉基因株系NbL7的木質素單體組成與野生型之間存在顯著差異，表明HtHCT基因對本氏煙木質素單體構成的影響較小。無論在擬南芥還是本氏煙中，G型木質素的含量一般與S型木質素的含量呈負相關，而H型木質素含量變化規律不明顯(表2)。

2.3.3 轉基因材料的類黃酮含量測定 鑒于HCT與查爾酮合成酶均可以香豆酰輔酶A為底物，并分別將苯丙烷代謝引入木質素單體合成及類黃酮合成途徑[6]。因此，本研究也測定了轉基因材料的類黃酮含量。

以吸光度值為橫坐標，不同濃度的蘆丁標準品為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線的回歸方程為y=31.625x-1.330 2(R2=0.996 6)。據此，對類黃酮含量進行測定。結果表明，擬南芥轉基因株系AtL4和AtL8的類黃酮含量均極顯著地低于野生型，本氏煙中亦有2個轉基因株系(NbL3、NbL9)的類黃酮含量顯著或極顯著低于野生型含量(表2)。

表2 轉基因植株生理生化指標測定Table 2 Determination of physiological and biochemical indicators of transgenic plants

3 討 論

木質素是重要的植物代謝產物，通過現代生物技術手段調節植物木質素代謝已成為研究熱點，這不僅有利于抗倒伏植物新品種的培育，而且有利于植物資源在造紙、生物能源等方面的應用。

HCT是將苯丙烷代謝產物香豆酰輔酶A引入木質素單體合成的關鍵節點，在木質素合成過程中具有重要作用[26]。HCT基因表達量的變化對植物木質素的含量及組成具有重要影響。擬南芥HCT基因沉默后，葉片顏色加深，S型木質素含量降低，植株生長受抑制，部分材料出現不育現象，但類黃酮含量增加。本氏煙HCT基因沉默后，木質素含量降低，木質素組成亦發生改變(S型木質素減少，H型木質素增多)，其部分植株矮化[7,27]。紫花苜蓿(Medicagosativa)HCT基因的下調表達，會顯著降低木質素含量并改變其組成，但卻提高了類黃酮含量、紫花苜蓿消化率及其對逆境脅迫的抗性[28-29]。為解析菊芋HtHCT基因的功能，本研究構建了植物表達載體pCAMBIA1390-HtHCT，并分別轉化了擬南芥和本氏煙草。與野生型擬南芥相比，3個轉基因株系的總木質素含量表現不一，其中兩個株系含量升高，而AtL8卻顯著降低。本氏煙草中亦有兩個株系含量增加，一個株系(NbL9)含量降低。說明HtHCT基因的導入能夠影響受體木質素代謝，與前人研究結果[27-28,30]一致。與野生型相比，擬南芥轉基因株系AtL8和煙草轉基因株系NbL9的木質素含量呈現下降趨勢，可能是外源HtHCT基因的表達抑制了擬南芥和本氏煙中自身HCT基因的表達而出現了共抑制現象[31]，與韓伯濤等[32]的研究結果相近。從木質素組成看，轉入HtHCT基因后，擬南芥和本氏煙的木質素組成均發生了不同程度的改變，且G型和S型木質素含量之間存在此消彼長的負相關關系，而H型木質素含量變化規律不明顯。HCT基因通常以基因家族的形式存在于植物基因組中，且不同物種間HCT基因家族成員的數目亦有不同[9]。本試驗在前期同源克隆‘廊芋8號’HtHCT基因的基礎上，對該基因進行初步功能研究。由于菊芋是向日葵屬六倍體物種(2n=6x=102)，其基因組大小及全基因組序列均未知[33]，對全基因鑒定和分析菊芋HCT基因造成了極大困難，并導致有關菊芋HCT基因數目、結構、染色體分布及表達特性的信息十分匱乏。因此，在以后的研究中，可以借助轉錄組測序及其他已公布基因組序列的向日葵屬物種信息來挖掘更多的菊芋HCT基因，并結合基因表達分析和HCT酶活分析，篩選在木質素合成過程中發揮主要作用的HCT基因[9]用于菊芋木質素含量的遺傳改良。查爾酮合成酶也可以香豆酰輔酶A作為底物，從而將苯丙烷代謝引向類黃酮物質的合成，因此其與HCT間可能存在一定的底物競爭，故本研究也測定了轉基因植物中的類黃酮含量。除本氏煙轉基因株系NbL7外，在其余的擬南芥和本氏煙轉基因材料中，類黃酮含量較野生型材料均發生不同程度的下降，這與Besseau等[7]在HCT基因發生沉默的擬南芥株系中測得較高的類黃酮含量結果相近。木質素合成過程復雜，受多種酶的調控及時間、空間和外界環境的影響[34]，而相較于單個酶基因的調節，同時調節多個木質素合成相關酶基因對木質素的改良效果更明顯[35]。此外，植物木質素含量的調節應在一定的范圍內，既要保證植物的正常生長，還要兼顧實際生產中對木質素含量和組成的要求[36]。

本研究在擬南芥和本氏煙中異源表達菊芋HtHCT基因，初步探明了該基因在木質素合成過程中的作用。在后續的研究中，筆者將繼續挖掘菊芋木質素代謝相關基因，建立和完善菊芋的遺傳轉化體系，以期為菊芋木質素含量的遺傳改良奠定基礎。