枯草芽孢桿菌DNKAS對分枝列當的防效、安全性及作用機理

崔華星，許俊鋒，崔衛東，包慧芳，詹發強，韋龍石，龍宣杞，楊 蓉，史應武,王 寧

(新疆農業科學院 微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091)

列當是列當科(Orobanchaceae) 列當屬(OrobancheL.) 多年生、兩年生或一年生肉質寄生草本。以吸根寄生在茄科、豆科、亞麻科、傘形科、十字花科等根上，吸收寄主養分、生長激素和水分以維持自身生長[1-2]，造成寄主作物減產甚至絕收。中國新疆由于優異的地理氣候條件，從20世紀90年代后期大力發展以番茄為代表的“紅色產業”，2016年新疆加工番種植面積6.9萬hm2，產量761萬t,番茄醬年產160萬t，是亞洲最大的番茄生產和加工基地。然而，近年新疆地區加工番茄受列當危害日益嚴重，每年受列當影響加工番茄的種植面積約為7000hm2左右,嚴重影響產業發展[3]。

如何減輕列當對作物的危害是世界性難題。目前，常見措施有化學防治(污染環境)、培育抗性品種(影響番茄品質)、種植誘捕和捕獲作物(需要輪作倒茬)、人工拔除(輕度地塊有效)等[4]。微生物防除由于綠色高效的特點日益受到人們重視[5],關于生防菌的研究主要集中在真菌[6]和放線菌[7]的應用。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛應用于植物病害防治，并取得良好效果，但用于列當防治的研究較少。新疆特殊環境微生物重點實驗室前期發現枯草芽孢桿菌DNKAS菌株會抑制分枝列當種子萌發，在此基礎上針對生防菌對分枝列當寄生體系的影響進行研究，為日后分枝列當的防除工作提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株為枯草芽孢桿菌DNKAS，由北京達農生物科技有限公司提供；番茄品種：盆栽試驗為易感品種‘87-5’，購自新疆天地禾種業有限公司，大田試驗為‘亨氏TH1601’，由中糧昌吉番茄公司提供；DNKAS菌粉，由北京達農生物科技有限公司提供，施用劑型為可濕性粉劑，活菌濃度達 1×1011CFU·g-1；人工合成獨腳金內酯類似物GR24，購自北京酷來搏科技有限公司；酶活試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 菌株DNKAS對分枝列當的盆栽防效測定

培養土配制：土壤過0.5 cm×0.5 cm篩，將過篩土壤、蛭石和草炭按體積比2∶1∶1配制培養土。接種土配制：每千克培養土添加0.25 g分枝列當種子并混勻，備用。取100 g接種土于7 cm×7 cm×11 cm的營養缽中，將長勢一致4～6葉番茄苗移入營養缽中，每個營養缽2株番茄，采用灌根方式于移栽當天、第20天、第30天將 5 mL 1×107CFU·g-1DNKAS菌液隨水澆入營養缽內，以不加菌液為對照，并加入等量清水，每個處理12個重復，在溫度 23～30 ℃、相對濕度 60% 以上的日光溫室中培育，按需澆水施肥，并于60 d后統計列當出土情況，計算寄生強度和防治效果。

寄生強度=分枝列當總株數 / 被寄生的寄主株數；防治效果=(對照寄生度-處理寄生度)/ 對照寄生度×100%。

1.3 菌株DNKAS對分枝列當的田間防效測定

選新疆昌吉地區受分枝列當寄生嚴重地塊，供試番茄品種為‘亨氏TH1601’，4月份溫室育苗，6月15日移栽，9月12日采收。生防菌DNKAS菌劑施用面積 32 hm2，以不施菌劑為對照，分4次隨水滴灌，時間分別為6月15日7.5 kg/hm2、7月3日15 kg/hm2、7月17日7.5 kg/hm2、8月9日7.5 kg/hm2。待番茄生長中期列當出土后，各處理取3個樣點采樣，每樣點取長70 m、寬1.5 m，共105 m2調查分枝列當發生情況，計算寄生強度和防效。采收時每處理取3個樣點，每樣點取長3 m、寬1.5 m,共計4.5 m2測產，并統計百果質量和病蟲果數。

1.4 菌劑對常規作物的生長安全性評價

在溫室盆栽條件下，將2 kg培養土裝入 25 cm×12 cm×15 cm花盆中，每盆放置甜瓜、棉花、辣椒、向日葵、番茄種子4～6顆，按Z型排布播種，施菌量為1.5 g，以不加菌粉為對照，每個處理3個重復，每兩周補充1次菌劑，每盆劑量為0.01 g，45 d后測量加工番茄苗株高、莖粗、葉寬、葉長、根長，通過表觀生長指標初步評價菌劑施用的安全性。

1.5 酶活試驗

將“1.2”中營養缽試驗的番茄苗于9月10日取出洗凈，按照南京建成生物工程研究所試劑盒試驗步驟測量番茄根部和列當的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和抗壞血酸過氧化物酶 (Ascorbate peroxidase,APX)酶活。

1.6 數據處理

試驗數據采用SPSS19.0軟件進行配對樣本t檢驗，以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 菌株DNKAS對分枝列當的防效

表1、表2分別是溫室條件及田間條件測定的菌劑防效結果。數據表明，盆栽條件下，經菌劑處理后，分枝列當寄生數減少15.17，寄生度下降7.58，防治效果達49.7%。大田試驗條件下，施用菌劑后分支列當寄生數下降43.07%，寄生度減少43.01%，田間防效可達43.1%,同時，番茄產量增加45.91%，單果質量提高45.89%，病蟲果數降低48.5%。因此，枯草芽孢桿菌DNKAS的施用對分枝列當有顯著防治作用，可提高番茄產量及果實等級。

表1 DNKAS菌劑對分枝列當的盆栽防效Table 1 Control effect of DNKAS bactericide on Orobanche aegyptiaca pot cultivation

表2 DNKAS菌劑對分枝列當的大田防效Table 2 Control effect of DNKAS bactericide on Orobanche aegyptiaca in field

2.2 菌株DNKAS對常見作物的生長指標影響

為評價田間使用安全性，在溫室初步檢測菌劑施用對5種常見作物(甜瓜、棉花、辣椒、向日葵和番茄)生長的影響。在播種45 d內，共施菌劑4次。從表3可以看出，菌劑施用對辣椒的株高、莖粗、葉長有促進作用，增加率分別為19.39%、 20.24%、23.28%，菌劑可增加向日葵的葉寬 (4.11%)，番茄的莖粗(20.60%)及葉寬 (20.76%)，棉花的株高、莖粗、葉長、葉寬同樣增加顯著，分別為19.35%、29.64%、40.11%、 16.29%；同時，對分枝列當的另一寄主植物甜瓜株高、葉寬也有促進作用。整體而言，該菌劑對作物有部分益生作用，植株生長正常，根長指標雖均無正向促進作用，但亦無抑制作用，可初步判斷施加菌劑對這5種植物的生長是安全的。

2.3 菌劑對寄生體系防御酶活性的影響

由圖1可見，正常寄生情況下，分枝列當植株體內抗性酶活要比番茄根部同類酶活水平高，苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和抗壞血酸過氧化物酶活性分別高出92.48%、 25.84%、84.45%、24.12%。施用菌劑后，分枝列當的這4種酶活依然比根部酶活性高，相比分別高出43.01%、127.93%、41.42%、25.88%。作為全寄生性植物，已報道分枝列當體內分解代謝類酶活整體會高于寄主植株中的相關酶類，本試驗表明，此結論也適用于植物的防御酶系。同時，菌劑的施入可降低番茄與列當之間諸如苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性之間的差別，因此相比原體系，可使番茄部分抗性酶活性得到強化，但也會使分枝列當的超氧化物歧化酶得到更多的增強。從寄生體系中單一植株來看，施用枯草芽孢桿菌DNKAS后，加工番茄根部苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶活性與對照相比差異明顯，加工番茄根部酶活分別增加7.72%、111.41%、24.24%、 14.06%，分枝列當酶活與對照相比，苯丙氨酸解氨酶增加44.32%、多酚氧化酶增加137.59%、超氧化物歧化酶增加53.53%、抗壞血酸過氧化物酶增加 15.67%。這與先前部分文獻認為生防菌劑可提高植物誘導獲得性抗性結論一致[8-9]。

表3 DNKAS菌劑施用后作物的生長指標Table 3 Crop growth under treatment of bactericidal agent of DNKAS

3 討 論

枯草芽孢桿菌對環境有較強的適應性，具有可在植物或土壤中大量繁殖和定殖、競爭營養位點和空間位點、誘導抗性、促生、增產和拮抗等特性，廣泛用于植物病害防治[10-11]，擁有作為列當生防菌的潛力。

盆栽試驗表明，枯草芽孢桿菌DNKAS通過降低加工番茄根部分枝列當寄生數量，從而提高防除效果。結合新疆特殊環境微生物重點實驗室前期工作，枯草芽孢桿菌DNKAS主要是通過抑制分枝列當萌發數量和縮短已萌發分枝列當芽管長度雙重作用下，減少列當萌發率和芽管接觸到加工番茄根部的概率來增加防除效果。加工番茄移栽1個月內是分枝列當寄生的關鍵時期，此時菌劑的施用是緩解寄生危害的最敏感時期。

圖1 寄生體系的防御酶變化Fig.1 Changes of defense enzymes in parasitic system

在大田試驗中，枯草芽孢桿菌DNKAS通過降低分枝列當寄生數量，使加工番茄增產。列當寄生數量和產量是評判生防菌防治效果的關鍵指標。尖孢鐮刀菌Br-2[12]和密旋鏈霉菌[13]能夠減少列當寄生數量，提高防效，使作物增產。本研究中，菌劑通過降低分枝列當出土量，減輕由于分枝列當寄生對加工番茄的影響，使單個果實質量增加，進而增產。病蟲果數減少，可能是由于枯草芽孢桿菌對病原菌引起的疾病具有直接和間接的生物抑制作用[14]。

微生物防治具有無殘留、不產生耐藥性等優點，被認為是最有可能替代化學殺菌劑的方法之一。但生防菌的大量引入不可避免地會影響農田植物的正常生命活動。試驗結果顯示，菌株DNKAS施用后在一定程度上能夠促進5種田間常規作物的生長。但要開發出能夠真正在田間使用且對農作物安全、對列當高度致病的生防菌劑，還需要進行模式動物急性毒性試驗及對環境微生態影響的試驗。

被分枝列當寄生期間，加工番茄和分枝列當酶活力均有所提升，列當體內酶活力高于加工番茄，且酶活力變化趨勢與加工番茄根部酶活力變化趨勢一致。Aybeke等[15]研究發現鐮刀菌通過提高寄主多酚氧化酶活性，消除列當寄生時產生的活性氧以減輕列當危害。Mabrouk等[16]報道根瘤菌提高豌豆中多酚氧化酶和過氧化物酶活性，使豌豆根部產生更多的酚類化合物和木質素進而增強對鋸齒列當抗性。加工番茄根部酶活力升高是由于生防菌有助于增加加工番茄根部PAL、PPO、SOD、APX酶活力。列當種子是通過穿透植物根部韌皮部和木質部完成寄生的。在列當種子萌發寄生前，PAL和PPO升高表明枯草芽孢桿菌DNKAS增加了加工番茄細胞壁厚度、組織木質化程度，提高分枝列當芽管穿透加工番茄根部的難度。SOD和APX活性與抗氧化能力呈正相關，活性增加表明菌劑增強了加工番茄的抗逆性。活性氧是致病菌感染的常見副產物[15]。活性氧通過超氧陰離子、過氧化氫自由基、過氧化氫等多種有害自由基干擾細胞內穩態和氧化還原系統，破壞核酸、蛋白質和脂質。APX和SOD能夠快速消滅活性氧，阻止有害H2O2水平的積累，因此可防止分枝列當寄生[17-19]。

導致分枝列當根部酶活力總體高于加工番茄根部酶活力，且酶活力變化趨勢與加工番茄根部酶活力變化趨勢一致的原因尚不明確。目前，尚無對比研究生防菌對寄主與列當之間酶活性變化的報道。Lilach等[20]通過研究寄主與列當之間內生菌群落變化發現，列當寄生植物后，兩者內生菌群落變得越來越相似。造成這種現象的原因是內生菌群落可以借助植物體內維管束傳播，而列當通過吸器伸入到植物的木質部和韌皮部吸收寄主養分和水分，進而造成內生菌從植物遷移到列當中，使內生菌群落變化趨于相似。列當體內大部分免疫抗性酶活性高于寄主植物，可能由于施用生防菌后植物體內形成免疫刺激信號，列當吸收植物營養代謝時感知到信號并在體內形成響應。

枯草芽孢桿菌DNKAS適應環境能力強，易于培養，防治效果好，可在移苗時隨水滴灌用于防治列當，是一種潛在的優秀生防菌。