細胞壞死抑制劑TAK-632治療急性胰腺炎的療效及分子機制

沙如拉, 秦瑞海, 王熠偉, 達胡拉巴藝拉

(1. 內蒙古自治區人民醫院 腫瘤內科, 內蒙古 呼和浩特, 010017;2. 內蒙古自治區第四醫院 內科, 內蒙古 呼和浩特, 010010)

急性胰腺炎(AP)是多種病因引起的胰酶激活從而引起胰腺組織的自身消化、水腫、出血，甚至壞死，繼而導致胰腺局部炎癥反應[1-2]。胰腺組織的壞死程度決定了AP患者的預后。細胞程序性壞死是由腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族以及Toll樣受體(TLR)家族、DNA依賴性干擾素調節因子激活因子(DAI)等與其對應的配體結合誘發的細胞死亡[3-4]。研究[5-6]顯示，細胞程序性壞死與AP發生密切相關，參與了AP的進展過程，能夠有效阻斷細胞程序性壞死路徑，有助于減慢患者AP進程。TAK-632是強效泛Raf抑制劑，目前研究[7]顯示, TAK-632可作用于細胞程序性壞死過程中受體相互作用蛋白 (RIP) 1和RIP3，進而調節細胞程序性壞死。本研究探討TAK-632對AP的治療作用機制，為臨床治療AP提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

60只無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠(體質量約200 g)購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證號為SCXK(滬)2015-0005, 倫理審批號為HP2019-029; HE染色試劑盒購自上海碧云天生物有限公司; 牛磺酸膽酸鈉購自美國Sigma公司; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6) 酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒購自美國R&D公司; 血清淀粉酶試劑盒購自上海仁捷生物有限公司; RIP3、混合譜系激酶結構區域樣蛋白(MLKL)、磷酸化RIP3、磷酸化MLKL兔多克隆抗體購自美國CST公司，HRP標記羊抗兔二抗購自上海生工生物有限公司。

1.2 分組、動物模型建立及治療

將60只大鼠隨機分為對照組、模型組和TAK-632組，每組20只，模型組和TAK-632組大鼠經腹腔注射0.3%的戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，備皮消毒。在上腹劍突下做切口進入腹腔，暴露十二指腸和胰膽管，并在胰膽管遠端按鈕膽管靠近肝門處用血管夾夾閉，于十二指腸乳頭附近將0.45 mm頭皮針經十二指腸穿入腸腔，逆行插入胰腺并用血管夾固定。微量泵推注5.00%牛膽酸鈉溶液，結束后觀察5 min, 待周圍組織出現棕紅色后拔出頭皮針，取下血管夾，使十二指腸復位，關閉腹腔。對照組手術時不泵入牛黃膽酸鈉。建模后24 h后對照組和模型組大鼠經腹腔注射生理鹽水, TAK-632組大鼠經腹腔注射25 mg/kg TAK-632。

1.3 大鼠血清淀粉酶檢測

對照組、模型組和TAK-632組大鼠治療72 h后，采集靜脈血，分離血清，測定血清淀粉酶的活性。

1.4 HE染色及評分

3組大鼠麻醉處死后，采用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成厚度6 μm的切片。采用二甲苯脫蠟，梯度無水乙醇水化后，蘇木精染色5 min, 流水沖洗。5.00%乙酸分化1 min, 流水沖洗，分化后顏色成為藍色。伊紅染色1 min, 流水沖洗。再采用70.00%、80.00%、90.00%、100.00%酒精處理各10 s, 二甲苯處理1 min, 中性樹膠封片。顯微鏡下觀察胰腺組織病理學改變，采用Spormann標準進行組織病理學評分。

1.5 ELISA檢測血清炎癥因子

采用ELISA試劑盒檢測大鼠外周血清TNF-α、IL-1β和IL-6細胞因子表達水平，根據試劑盒說明書執行操作步驟。構建TNF-α、IL-1β和IL-6細胞因子濃度的標準曲線，利用標準曲線計算得到吸光值。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測蛋白表達

對照組、模型組和TAK-632組大鼠處理后，取胰腺組織，加入組織裂解液，充分勻漿后, 15 000 轉/min離心30 min, 收集細胞上清液，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE, 并轉移至PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h, 采用RIP3、MLKL、磷酸化RIP3、磷酸化MLKL在4 ℃下孵育12 h, 次日采用聚對苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯(PBST)洗滌3次，每次5 min; 然后采用羊抗兔二抗室溫封閉1 h, 采用發光液顯影。

1.7 統計學方法

應用SPSS 25.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，計量資料比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠存活率比較

對照組大鼠生存狀態良好，全部存活，存活率為100.00%。模型組大鼠出現精神萎靡、動作遲緩、運動能力下降、顫抖等癥狀，其中5只大鼠死亡，存活率75.00%。TAK-632組大鼠活動能增強，精神狀態好轉，大鼠全部存活，存活率為100.00%。與對照組和TAK-632組大鼠存活率比較，模型組大鼠存活率下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 3組大鼠胰腺組織病理學比較

對照組大鼠胰腺組織結構完整，無炎癥細胞浸潤、組織充血、水腫、紋理紊亂等癥狀。模型組大鼠胰腺組織細胞排列紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤，并伴有大量凋亡壞死、充血和水腫癥狀。經TAK-632治療后，大鼠胰腺組織紋理、水腫、充血等癥狀明顯緩解。模型組大鼠胰腺組織病理學評分高于對照組，差異有統計學意義 (P<0.05)。TAK-632組大鼠病理學評分低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

A: 對照組; B: 模型組; C: TAK-632組。圖1 對照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織病理學結果(放大200倍)

表1 對照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織病理評分和血清淀粉酶比較

2.3 3組大鼠血清淀粉酶比較

與對照組比較，模型組大鼠血清淀粉酶活性增加，差異有統計學意義(P<0.05)。TAK-632組大鼠血清淀粉酶活性高于對照組，但低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4 3組大鼠血清炎癥因子比較

ELISA結果顯示，模型組外周血TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。TAK-632組外周血TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于模型組，但高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

pg/mL

2.5 3組大鼠程序性壞死通路蛋白水平比較

Western blot結果顯示，對照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織總RIP3和MLKL蛋白水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠胰腺組織磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。TAK-632組大鼠胰腺組織中磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 對照組、模型組和TAK-632組大鼠胰腺組織程序性壞死通路蛋白表達水平比較

3 討 論

AP是一種以胰腺腺泡細胞壞死為主要特征的危重疾病[8]。細胞壞死伴隨于AP的整個過程，主要由炎癥因子所介導[9-10], 細胞壞死過程是一種依賴于RIPK1和RIPK3激酶活性的細胞死亡方式，死亡信號誘導RIPK3激酶的激活，進而磷酸化細胞壞死的特異性執行蛋白MLKL[11]。磷酸化的MLKL發生寡聚化并轉位到細胞膜結構上，導致細胞膜和細胞器膜破壞，以致細胞死亡和胞內物質外漏[12]。本研究采用牛黃膽酸鈉誘導大鼠發生AP, 可見大鼠胰腺組織出現明顯炎癥細胞浸潤，并伴有大量凋亡壞死細胞，并出現充血和水腫癥狀。與對照組大鼠比較，建模后大鼠血清炎癥因子、TNF-α、IL-1β和IL-6水平、病理學評分和血清淀粉酶等指標顯著增高。磷酸化RIP3和MLKL水平顯著上調，提示AP大鼠胰腺組織出現了明顯壞死等細胞生物學現象。

TAK-632是細胞程序性壞死的抑制劑，細胞水平可作用于RIPK1和RIPK3激酶，影響激酶活性，進而影響細胞程序性壞死[13-14]。本研究結果顯示, TAK-632處理AP后可顯著緩解AP臨床癥狀，降低胰腺組織病理學評分以及血清淀粉酶等指標，說明TAK-632對AP具有治療作用。

作用機制分析結果顯示, TAK-632可顯著下調AP大鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥水平。炎癥因子所致的級聯反應是造成胰腺組織凋亡和壞死的主要因素，可加速AP的發病和進程，其中TNF-α是細胞程序性壞死的主要誘導因子，可與胰腺細胞表面的TNFR結合，促進蛋白激酶RIP1和RIP3傳導死亡信號并形成壞死復合體，誘導細胞壞死[15-16]。RIP3和MLKL是細胞程序性壞死過程中的核心蛋白，其磷酸化可激活細胞程序性壞死。本研究發現, TAK-632并不影響AP組織中RIP3和MLKL蛋白表達水平，但可顯著下調磷酸化RIP3和MLKL水平，進而抑制細胞程序性壞死。

綜上所述, TAK-632可顯著下調AP大鼠炎癥水平，抑制細胞程序性壞死信號通路，進而緩解AP, 降低AP大鼠的病死率。