東方蜜蜂微孢子蟲蓖麻毒素B凝集素基因的分子克隆及生物信息學分析

范元嬋 王 杰 孫明會 吳 鷹 余岢駿 王心蕊 葉亞萍 錢加珺 張凱遙 王思懿 陳大福，2 郭 睿，2*

(1.福建農林大學 動物科學學院(蜂學學院)，福州 350002；2.福建農林大學 蜂療研究所，福州 350002)

東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)是一種專性侵染成年蜜蜂中腸上皮細胞的單細胞真菌病原[1]，蜜蜂罹患微孢子蟲病可引起蜂群群勢和生產力的較大衰減。東方蜜蜂微孢子蟲以孢子的形式在蜜蜂個體之間傳播，通過攝食經口進入宿主中腸，在特殊的理化環(huán)境刺激下以“極絲彈射”將具有感染性的孢原質注入上皮細胞，然后利用宿主細胞的物質和能量滿足增殖所需[1-3]。東方蜜蜂微孢子蟲感染能使蜜蜂宿主的糖消耗量增加、壽命縮短、免疫基因抑制、細胞凋亡抑制、采集積極性下降以及采集日齡提前[4-5]。目前，由于微孢子蟲的轉基因操作技術體系尚未建立，絕大多數(shù)微孢子蟲的基因功能研究滯后。高通量測序技術為微孢子蟲的相關研究提供了有力工具。前人對東方蜜蜂微孢子蟲進行了一些轉錄組研究，例如Huang等[6]曾對東方蜜蜂微孢子蟲侵染的西方蜜蜂工蜂中腸進行轉錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)病原在宿主細胞中的增殖受到抑制，且己糖激酶、ABC轉運體和蓖麻毒素B凝集素(Ricin B-lectin)等毒力因子的基因表達水平下調；Rodríguez等[7]將極管蛋白3編碼基因的dsRNA飼喂西方蜜蜂工蜂，結果表明宿主中腸內的孢子載量顯著降低，宿主的天然免疫力提升，其生理性能改善，壽命增加；Paldi等[8]通過飼喂西方蜜蜂與東方蜜蜂微孢子蟲同源的ATP/ADP轉移酶基因的dsRNA，可以有效抑制中腸中東方蜜蜂微孢子蟲的數(shù)量，降低蜜蜂對低濃度糖水的敏感度，這一過程可能僅由病原介導也可能是宿主體內有與病原相同的RNA沉默系統(tǒng)。本研究前期對東方蜜蜂微孢子蟲進行了較系統(tǒng)的組學研究，首次鑒定到204條環(huán)狀RNA(Circular RNA, circRNA)[9]和83條長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)[10]，并深入解析了東方蜜蜂微孢子蟲侵染意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica，簡稱意蜂)工蜂的分子機制[11-13]。蓖麻毒素是一種異源二聚體蛋白，屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白家族，其相對分子質量約為65 ku，由A(RTA)和B(RBL)兩條鏈組成，兩條鏈以鏈間二硫鍵(S-S)相連接[14]。凝集素是識別聚糖配體的蛋白質，其作為眾多病原的毒力因子，具有介導細胞黏附，可通過干擾細胞膜氧化還原條件協(xié)助病原侵染宿主[15]。RBL蛋白通過與細胞表面的糖蛋白結合介導A鏈進入細胞發(fā)揮毒力作用。在家蠶微孢子蟲(N.bombycis)中已鑒定出21個RBL蛋白編碼基因，它們以串聯(lián)形式分布在基因組[14]。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)RBL蛋白可增加家蠶微孢子蟲在侵染家蠶(Bombyxmori)卵巢細胞(BmN)時的粘附性。蜜蜂微孢子蟲(N.apis)是東方蜜蜂微孢子蟲的姐妹種，其基因組僅含有1個RBL基因[16]。RBL蛋白具有多個半乳結合位點功能域，能夠與細胞表面的多糖蛋白及糖脂中的半乳糖殘基結合從而介導RTA進入細胞，故具有凝集素作用[17]。東方蜜蜂微孢子蟲基因組包含9個RBL基因[18]，但缺乏深入的研究。本研究前期利用基于鏈特異性cDNA建庫的RNA-seq技術對東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子進行深度測序，并基于高質量的組學數(shù)據(jù)分析篩選出東方蜜蜂微孢子蟲NCRBL-081基因。在此基礎上，本研究擬首先對NCRBL-081基因的進行分子克隆，再預測NCRBL-081基因的開放閱讀框(ORF)及編碼的氨基酸序列，并預測NCRBL-081蛋白的信號肽、磷酸化位點和二級結構，進而對東方蜜蜂微孢子蟲與其他3種微孢子蟲的RBL蛋白進行系統(tǒng)進化分析，以期解決NCRBL-081基因研究不夠深入的問題，并為NCRBL-081基因及其編碼蛋白的功能研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子由福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)蜜蜂保護實驗室制備[19-20]。

1.2 東方蜜蜂微孢子蟲的RBL基因來源

本研究前期已利用Illumina測序技術對東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子樣品進行測序[12]，基于測序所得高質量的轉錄組數(shù)據(jù)篩選出9條RBL基因，其中AAJ76_100008081(命名為：NCRBL-081)在東方蜜蜂微孢子蟲侵染意蜂工蜂過程中的表達量持續(xù)上調[12]，表明了該基因在病原侵染過程中的潛在重要性。因此，本研究選擇NCRBL-081進行分子克隆及相關生物信息學分析。

1.3 RBL基因的分子克隆與Sanger測序

利用DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司，中國)提取東方蜜蜂微孢子蟲孢子的基因組DNA，作為模板進行PCR擴增。PCR體系包括：模板1 μL，PCR mix 10 μL，上下游引物各1 μL，無菌水7 μL。PCR程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像儀(上海培清，中國)下進行觀察并對目的片段進行切膠。采用膠回收試劑盒(Vazyme公司，中國)回收目的片段，然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa公司，中國)，反應體系包括：pMD19-T載體 1 μL，目的片段10 μL，solution 5 μL，無菌水4 μL。在16 ℃金屬浴中進行連接反應2 h。將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，并在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行涂板，然后放入37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，用無菌的牙簽挑取單菌落放入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，最后取1 mL放入無菌的EP管送至生工生物工程(上海)公司進行雙端測序，采用M13引物。

1.4 RBL基因的生物信息學分析

根據(jù)NCRBL-081的核酸序列，利用NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)上的ORF工具預測NCRBL-081編碼的氨基酸序列。再根據(jù)蛋白質的氨基酸序列，利用ExPASy網站(https:∥web.expasy.org/protparam/)上的Protparam、ProtScale、HMMTOP、SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、SOPMA和SWISS-model等軟件預測NCRBL-081編碼蛋白的理化性質、跨膜結構域、信號肽、磷酸化位點、二級和三級結構模型。

1.5 4種微孢子蟲RBL蛋白的系統(tǒng)進化樹構建及分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中查詢和下載東方蜜蜂微孢子蟲所有RBL蛋白的氨基酸序列，以及家蠶微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲和兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozooncuniculi)的RBL蛋白的氨基酸序列。通過Clustalx軟件[21]將上述4種微孢子蟲的RBL蛋白的氨基酸序列進行多重比對。再利用MEGA-X軟件[22]構建和分析微孢子蟲的RBL蛋白系統(tǒng)進化樹，使用軟件默認參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 NCRBL-081的分子克隆

PCR擴增產物的電泳結果顯示，擴增片段大小(約700 bp)符合預期(圖1)。Sanger測序結果顯示克隆出的NCRBL-081的核酸序列與轉錄組測序結果中該基因的核酸序列一致性為100%，說明成功克隆到東方蜜蜂微孢子蟲的NCRBL-081基因。

1: NCRBL-081; 2: 無菌水 (陰性對照); M: DNA標準分子量標記。1: NCRBL-081; 2: Sterile water (negative control); M: DNA marker.圖1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR amplification products

2.2 NCRBL-081編碼蛋白的預測和分析

NCRBL-081共含有630個核苷酸，可編碼209個氨基酸，氨基酸序列為MLIFFRVISKMLILFLFSAIYSEELQFLVKGFGMYICTKDGYTLYGCSDKSYISKFLLEYDNNGKLFIISPKYNKIFDIANNESLILWPKHGGPNQVFELNWINNKEFMLMNREKCVVYNDVTNKFDYKDCKLGSERNKLFKVGPDEERPEQLTRPSLISPTHDNEHAEDDSCSCFDEPIRRKRRHRHHIDDPHYRRRGGHRHYRPMKR。該編碼蛋白的分子式為C1123H1700N312O312S12，相對分子質量約為25 ku，等電點為8.93，親水性為-0.682。此外，該編碼蛋白為親水性蛋白。

NCRBL-081編碼蛋白中含有1個典型的信號肽，說明其為分泌型蛋白(圖2(a))。磷酸化位點預測結果顯示，NCRBL-081編碼蛋白還包含9個絲氨酸磷酸化位點、6個酪氨酸磷酸化位點和1個蘇氨酸磷酸化位點(圖2(b))。二級結構預測結果顯示該編碼蛋白含有20.10%的α螺旋，8.61%的β折疊，25.84%的延伸鏈及45.45%的無規(guī)卷曲，在11-29個氨基酸的位置有1個跨膜結構域(圖2(c))。該編碼蛋白的三維結構表現(xiàn)出外顯β-1,3-半乳聚糖酶1,3Gal43A的晶體結構，是Ⅱ型核糖體失活蛋白家族的典型特征(圖2(d))。

(c)藍: α螺旋; 紅: 延伸鏈; 綠: β折疊; 紫: 無規(guī)則卷曲。(c) blue: α helix; red: extended chain; green: β corner; purple: irregular curl.圖2 NCRBL-081編碼蛋白的信號肽(a)、磷酸化位點(b)、二級結構(c)和三級結構(d)Fig.2 Signal peptide (a), phosphorylation site (b), secondary structure (c) and tertiary structure (d) of NCRBL-081 encoding protein

2.3 4種微孢子蟲RBL蛋白的系統(tǒng)進化樹

如表1所示，東方蜜蜂微孢子蟲基因組含有9個RBL基因，而蜜蜂微孢子蟲僅含有1個RBL基因[23]，家蠶微孢子蟲[24]和兔腦炎微孢子蟲[25]分別含有16和4個RBL基因。將上述4種微孢子蟲的RBL基因編碼蛋白進行多重比對，系統(tǒng)進化分析結果顯示同一個微孢子蟲物種的不同RBL蛋白進化距離較近，而不同微孢子蟲物種RBL蛋白進化距離較遠；此外，AAJ76_100008081與NCER_100581聚為一支，表現(xiàn)出較近的親緣關系(圖3)。

各分支上的數(shù)字為自舉值(1 000次重復抽樣檢驗)。Numerals on each node represent bootstrap values from 1 000 replicates.圖3 4種微孢子蟲的RBL蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of RBL proteins of four microsporidian species

表1 4種微孢子蟲的蓖麻毒素B凝集素編碼基因Table 1 Ricin B-lectin encoding genes in four microsporidian species

3 討論與結論

微孢子蟲僅在宿主細胞內增殖，在體外以休眠態(tài)的孢子形式存在[1]。東方蜜蜂微孢子蟲專性寄生成年蜜蜂中腸上皮細胞，但迄今尚沒有來源于蜜蜂組織或器官的體外傳代培養(yǎng)細胞系供東方蜜蜂微孢子蟲侵染，因而無法在細胞水平對東方蜜蜂微孢子蟲進行轉基因操作。2009年，Cornman等[26]測序并公布了東方蜜蜂微孢子蟲的基因組。Huang等[27]曾利用small RNA-seq技術探究了東方蜜蜂微孢子蟲感染1～6 d的西方蜜蜂工蜂的微小RNA(MicroRNA, miRNA)應答，發(fā)現(xiàn)宿主差異表達miRNA(Differentially expressed miRNA, DEmiRNA)可能通過調控物質代謝和能量代謝相關基因表達進行侵染應答。Dussaubat等[28]對受東方蜜蜂微孢子蟲脅迫的西方蜜蜂工蜂中腸轉錄組分析發(fā)現(xiàn)病原侵染抑制了參與腸道組織內穩(wěn)態(tài)和更新的通路及基因，推測這是導致蜜蜂宿主在侵染早期死亡的原因之一。

蓖麻毒素是一種細胞毒素蛋白，包含A鏈和B鏈，其中A鏈具有細胞毒素的作用，可導致核糖體失活；而B鏈屬于凝集素，能與細胞膜表面半乳糖受體結合進而協(xié)助A鏈進入細胞[29]。人們已在很多物種中鑒定到與蓖麻毒素B鏈結構相近的蛋白，這類蛋白統(tǒng)稱為RBL蛋白家族[30-31]。此前，東方蜜蜂微孢子蟲蓖麻毒素基因雖有少量報道，但都是基于生物信息學方法的預測結果，缺少更深入的研究。在前期研究基礎上，本研究通過PCR對東方蜜蜂微孢子蟲的的NCRBL-081基因進行擴增，Sanger測序結果證實克隆出的序列確為NCRBL-081基因。這為進一步開展NCRBL-081基因的功能研究提供了必要基礎。另外，上述結果也說明基于Illumina HiSeq平臺得到的轉錄組測序數(shù)據(jù)具有較高的準確性，可作為基因克隆的重要資源，這與前人的研究報道一致[33-35]。李能章[14]曾對家蠶微孢子蟲的21個RBL基因進行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)RBL基因主要以串聯(lián)形式分布在第6號和463號Scaffold上，其中9個RBL基因的N端含有真核生物典型的信號肽[2]，但只有2個RBL蛋白含有跨膜結構域。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)RBL蛋白能夠增強家蠶微孢子蟲對BmN細胞的粘附性。東方蜜蜂微孢子蟲孢子經極絲彈射將具有感染性的孢原質注入宿主細胞，隨后進入增殖周期，利用宿主的物質和能量進行增殖，孢子的數(shù)量逐漸增多，最終導致宿主細胞破裂，釋放出大量的成熟孢子，進而侵染周圍的正常細胞，或隨食物殘渣排出體外，繼續(xù)感染同一蜂群的其他蜜蜂個體或臨近的其他蜂群[1]。本研究發(fā)現(xiàn)NCRBL-081編碼蛋白在11～29個氨基酸的位置區(qū)域有1個跨膜結構域，同時1～21個氨基酸為1個信號肽。鑒于在翻譯過程中蛋白質的信號肽通常會切割掉，推測NCRBL-081編碼蛋白并不是膜蛋白，但該編碼蛋白在宿主細胞中合成后被分泌到胞外，協(xié)助成熟孢子粘附和侵染其他細胞。

在自然環(huán)境中，東方蜜蜂微孢子蟲的毒力比蜜蜂微孢子蟲更強，導致后者逐漸被前者取代[4]。本研究中，通過查詢和比較發(fā)現(xiàn)蜜蜂微孢子蟲僅含有1個RBL基因，而東方蜜蜂微孢子蟲含有9個RBL基因，更多的RBL基因或許是東方蜜蜂微孢子蟲具有更強毒力的原因之一。系統(tǒng)進化分析結果顯示東方蜜蜂微孢子蟲的AAJ76_100008081與NCER_100581聚為一支，推測在長期進化過程中該基因發(fā)生了復制，東方蜜蜂微孢子蟲侵染蜜蜂宿主的意義值得進一步研究。

綜上，本研究成功克隆了東方蜜蜂微孢子蟲的NCRBL-081基因，并對該基因的編碼蛋白進行了生物信息學分析，研究結果揭示了NCRBL-081蛋白的分子特征，并為深入開展NCRBL-081基因及其編碼蛋白的功能研究打下了基礎。