基于環介導等溫擴增技術的草莓枯萎病檢測

侯圣凡 劉峻杰 李小峰 王紅清

(中國農業大學 園藝學院，北京 100193)

草莓(Fragaria×ananassaDuch)種植周期短、結果早且經濟效益高，是一種重要的經濟作物。我國草莓主要采用設施栽培，多年的連續種植導致草莓根莖部病害頻繁發生，其中以真菌病害對草莓的影響最為顯著，嚴重制約了我國草莓產業的健康發展[1]。

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的枯萎病是一種毀滅性的土傳真菌病害，致病能力強，感染面積廣，被列為世界十大植物病原菌之一[2]。該菌有不同的專化型，分別能導致番茄、甜瓜、三七、辣椒、香蕉、西瓜、馬鈴薯和苜蓿等枯萎病發生，且分布廣泛，在全國各個種植區均有不同程度的發生[3-6]。草莓枯萎病是由F.oxysporumf. sp.fragariae(Fof)引起的，Fof能夠從根部快速侵染草莓，造成維管束堵塞，葉片不對稱或變形，最終致使草莓植株萎蔫和死亡。草莓枯萎病傳染性極強，幾乎無藥可施，因此對草莓枯萎病病原菌進行早期、特異性和準確的鑒定是有效控制病害的關鍵[7]。

環介導等溫擴增(LAMP)是一種新型、快捷方便、靈敏度極高且廉價的核酸擴增方法。LAMP法有2個關鍵技術[8]：首先是引物的設計，針對特異性靶序列的高度保守區域，設計4條引物以及2條環狀引物；其次是選用了Bst DNA聚合酶，該酶具有重要的鏈置換活性，能使LAMP擴增過程中發生鏈置換反應[9]。目前LAMP已被應用于植物病毒、類病毒、真菌、細菌和線蟲等方面的檢測[10-12]。近年來建立了許多新的方法用于Fof的檢測，Suga等[13]利用Han-Skippy 2個轉座元件之間的基因組區域設計了引物ForfaF和ForfaR，通過普通PCR的方法實現了對Fof特異性擴增；Hong等[14]以Han-Skippy基因區域為基礎，利用實時熒光定量PCR對Fof進行檢測；Burkhardt等[15]利用Han-Skippy區域設計重組酶聚合酶反應引物與Taqman熒光檢測相結合也實現了對Fof的鑒定，以上檢測手段都需要昂貴的檢測設備且檢測時間過長。針對草莓枯萎病的LAMP檢測技術國內還未見報道。因此，本研究以Fof特異性區域Han-Skippy為靶序列，利用SYBR Green I染料建立Fof的LAMP檢測技術，并通過組織培養法和PCR法加以輔佐驗證，以期實現草莓枯萎病的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究共選用16種北京地區草莓的重要病原菌或常見的土傳病原菌，其中F.oxysporumf. sp.fragariae3株，其他種類病原菌各1株(表1)。將上述菌株用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板在25 ℃下培養5 d后收集菌絲，使用BufferA和BufferB法提取DNA[1]，置于-20 ℃下保存備用。

表1 試驗用病原菌株Table 1 Pathogen strains in this test

1.2 引物設計

以Fof轉座子Han-Skippy[13]基因序列為靶序列，用LAMP在線設計軟件(http:∥primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html)選定了3套引物，但只有1套引物帶有Loop引物，故選擇此套引物作為最優的LAMP引物(表2)，各引物在靶序列的相對位置見圖1。

F3和B3為外引物；F2和F1為FIP內引物；B1和B2為BIP內引物；LF為環引物。F3 and B3 are external primers; F2 and F1 are internal primers FIP; B1 and B2 are internal primers of BIP; LF is loop primer.圖1 Fof-LAMP引物在Han-Skippy序列上的定位Fig.1 The location of Fof-LAMP primers on the aligned Han-Skippy sequence

表2 LAMP和PCR引物序列Table 2 LAMP and PCR primers used in this study

1.3 LAMP體系和反應條件優化

以Fof轉座子Han-Skippy基因區域為模板進行LAMP反應體系的優化，參考杜然等[16]的方法并加以改進。具體如下：以Bst DNA聚合酶(Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase)為基礎配制，具體成分包括：2.50 μL 10×Thermo Pol Buffer、0.25 μL Mg2+溶液(100 mmol/L)、1.00 μL dNTPs溶液(10 mmol/L)、1.00 μL FIP溶液(20 μmol/L)、1.00 μL BIP溶液(20 μmol/L)、0.50 μL F3(10 μmol/L)、0.50 μL B3(10 μmol/L)、0.75 μL LoopF溶液(10 μmol/L)、0.50 μL Bst DNA聚合酶溶液(8 U/μL)、1.00 μL Betaine(5 mol/L)、1.00 μL模板DNA溶液(450 ng/μL)，補足ddH2O至25.00 μL。將LAMP反應體系置于62.9 ℃水浴鍋中反應60 min，然后向該體系中加入0.40 μL的10 000×SYBR Green I染料，在紫外燈下觀察反應液顏色。熒光綠色為陽性，褐色為陰性。使用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳對反應液進行檢測，有梯形條帶為陽性，無條帶為陰性。

對LAMP反應因子Bst DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和各條引物的濃度分別進行條件優化。設置Bst DNA 聚合酶濃度梯度為0.08、0.16、0.24和0.32 U/μL,設置Mg2+濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mmol/L,設置dNTPs濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L。在最適Bst DNA聚合酶濃度(0.16 U/μL)、Mg2+濃度(1.0 mmol/L)和dNTPs濃度(0.4 mmol/L) 的條件下，設置內引物(FIP和BIP)濃度梯度為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μmol/L、外引物(F3和B3)濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L和正向環引物(Loop F)濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L。設置Betaine濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L。在各反應因子最佳的濃度條件下，優化LAMP反應溫度，在50.0～68.5 ℃范圍中，逐步鎖定最優反應溫度范圍。然后對LAMP反應時間梯度進行優化。每步驟重復3次。

1.4 LAMP反應靈敏度測定

提取Fof-DNA為模板，調整其濃度為450 ng/μL,然后將其以10倍梯度連續稀釋為45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL、45 pg/μL、4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL和4.5 fg/μL。每梯度取1 μL DNA作為LAMP反應模板，陰性對照使用ddH2O，在62.9 ℃水浴鍋中反應60 min。

同時，以各濃度梯度的Fof-DNA為模板進行常規PCR檢測。該PCR反應體系(25 μL)包括：12.5 μL 2×2*SWTaq酶Mix、正引物FofraF溶液(10 μmol/L)和反引物FofraR溶液(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板溶液1 μL，用ddH2O補齊至25 μL。ddH2O作為陰性對照。PCR反應程序：94 ℃ 預變形3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環；72 ℃延伸3 min。反應結束后，使用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，擴增的DNA條帶為239 bp。試驗重復3次。

1.5 LAMP反應特異性檢測

本研究所用的F.oxysporumf. sp.fragariae由本實驗室保存。其他用于特異性檢測的還包括層生鐮刀菌(F.proliferatum)、水稻惡苗病菌(F.fujikuroi)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、葡萄孢菌(B.cinerea)、煙疫霉菌(P.nicotianae)、螺旋疫霉(P.helicoides)、大麗輪枝菌(V.dahliae)、擬盤多毛孢(N.clavispora)、擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)、共享鐮孢菌(F.commune)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、鏈格孢菌(A.alternata)、總狀毛霉(M.racemosus)和柱孢菌(Cylindrocladiella)共16個草莓普遍存在的病原菌和常見土傳病原菌菌株。以ddH2O代替真菌DNA作為陰性對照。試驗重復3次。

1.6 利用LAMP體系檢測田間感病植株

從北京通州草莓大棚中隨即采集16株葉片枯萎、根部腐爛、維管束褐變，疑似草莓枯萎病癥狀的植株，以及1株健康草莓植株用于LAMP檢測。用刀片將發病以及健康的試驗樣品根莖部維管束病健交接處切下，各取0.15 g放入液氮中研成粉末，用TIANGEN-DNAsecure Plant Kit提取其中的DNA，置于-20 ℃下保存備用。分別以各草莓根莖樣品的DNA和Fof的DNA為模板，按LAMP體系進行反應。反應結束后在紫外燈下觀察反應管顏色變化并且進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時，利用Fof特異性引物FofraF和FofraR對田間樣品進行常規PCR檢測，進一步佐證LAMP試驗結果。試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系的建立

根據Fof轉座子Han-Skippy基因區域為模板設計了5條LAMP引物。LAMP引物包括2條內引物FIP和BIP、2條外引物F3和B3、1條環引物LoopF。通過對Fof反應體系和反應條件的優化，確定Fof-LAMP(25 μL)各反應因子的最佳終濃度為：Bst DNA聚合酶0.16 U/μL、Mg2+1 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、FIP和BIP各0.8 μmol/L、F3和B3各0.2 μmol/L、LoopF 0.3 μmol/L、Betaine 0.2 mol/L和0.4 μL SYBR Green I染料(表3)。

表3 檢測Fof的LAMP體系Table 3 The LAMP system to detect Fof

對Fof-LAMP反應溫度進行優化。結果表明，當溫度為57.5～65.9 ℃時，Fof-LAMP才會發生反應(圖2(a))。當溫度在58.0～65.4 ℃時，各溫度下反應液發出的熒光綠色亮度基本無異，但62.9 ℃下，反應液的瓊脂糖凝膠電泳條帶更亮(圖2(b))，說明Fof-LAMP反應效率更高，所以選擇62.9 ℃作為Fof-LAMP的最適溫度。

(a) M為分子量標記；1～7表示反應溫度分別為50.0、51.4、53.8、57.5、62.0、65.9和68.5 ℃,8為陰性對照；(b)M為分子量標記；1～7表示反應溫度分別為 58.0、58.6、59.6、61.1、62.9、64.4和65.4 ℃,8為陰性對照。圖片上半部分為 LAMP 檢測，下半部分為各樣品相對應的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖2、3和4同。(a) M is marker; 1 to 7 indicate that reaction temperatures are 50.0, 51.4, 53.8, 57.5, 62.0, 65.9 and 68.5 ℃, respectively, 8 is negative control； (b) M is marker; 1 to 7 indicate that Reaction temperatures are 58.0， 58.6， 59.6， 61.1， 62.9， 64.4 and 65.4 ℃, respectively, 8 is negative control.The upper part of the figure is LAMP detection; The lower part of the figure shows agarose gel electrophoresis detection corresponding to each sample.Fig 2, 3 and 4 are the same.圖2 Fof的LAMP反應溫度優化Fig.2 The temperature optimization of Fof LAMP reaction

在最適溫度條件下對Fof-LAMP的反應時間進行優化(圖3)。結果表明，當反應時間在45 min以上時，Fof-LAMP就會發生反應且各時間段間熒光綠色亮度無異。將各時間段的LAMP反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以看出當反應時間在60 min以上時，各時間段間電泳條帶亮度無異。說明當LAMP反應時間在60 min時，Fof-LAMP已反應充分，所以Fof-LAMP的最適反應時間為60 min。

M為分子量標記；1～7表示反應時間分別為15、30、45、60、75、90和105 min,8為陰性對照。M is marker; 1 to 7 indicate that reaction time are 15, 30, 45,60, 75, 90 and 105 min, respectively, 8 is negative control.圖3 Fof的LAMP反應時間優化Fig.3 The LAMP reaction time optimization of Fof

2.2 檢測LAMP反應的特異性

使用LAMP引物對草莓上常見的病原菌進行LAMP特異性檢測。結果表明，含有Fof的3個樣品(1號)反應后在紫外燈下發出熒光綠色，且在瓊脂糖凝膠電泳中有3條明亮的梯形條帶(圖4)。而2～16號中非目的病原菌反應后在紫外燈下未發出熒光綠色，且瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶，與17號陰性對照結果一致。故本研究設計的LAMP引物針對Fof具有良好的特異性。

M為分子量標記；1～16見表1各菌序號, 17為陰性對照。M is marker; 1 to 16 are Table 1 sequence number of pathogenic strains, 17 is negative control.圖4 Fof的LAMP特異性檢測Fig.4 Specificity test of Fof by LAMP assay

2.3 LAMP檢測的靈敏度

以10倍梯度稀釋的Fof-DNA為模板進行LAMP擴增，結果顯示當DNA濃度為450 ng/μL、45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL和45 pg/μL時LAMP反應呈SYBR Green I綠色，瓊脂糖凝膠電泳顯示有梯形條帶產生(圖5(a))，而DNA的濃度為4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL和4.5 fg/μL時LAMP反應呈褐色的陰性反應，說明該反應體系最低可檢測到的模板DNA濃度為45 pg/μL。而常規PCR擴增中，最低可檢測到的模板DNA濃度也為45 pg/μL(圖5(b))。因此，LAMP檢測的靈敏度與常規PCR一致。

M為分子量標記；1～9表示DNA濃度分別為450 ng/μL、45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL、45 pg/μL、4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL和4.5 fg/μL,10為陰性對照。(a)上半部分為LAMP檢測；下半部分為各樣品相對應的瓊脂糖凝膠電泳檢測。(b)常規PCR檢測。下同。M is marker; 1 to 9 indicated that the DNA concentrations are 450 ng/μL， 45 ng/μL， 4.5 ng/μL， 450 pg/μL， 45 pg/μL， 4.5 pg/μL， 450 fg/μL， 45 fg/μL and 4.5 fg/μL, respectively, 10 is negative control. (a) The upper part is LAMP detection; The lower part shows agarose gel electrophoresis detection corresponding to each sample on the upper part. (b)The conventional PCR assay. The same below.圖5 Fof的LAMP靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity test of the LAMP assay for Fof

2.4 LAMP體系檢測田間感病植株

分別從16株罹病草莓根莖部維管束病健交接處采集DNA將其作為模板進行LAMP和PCR檢測。結果表明在Fof陽性模板以及2～13號發病植株的反應產物顯現熒光綠色，且擴增出梯形DNA條帶(圖6(a))；而陰性模板、健康草莓根莖模板以及14～17號發病植株反應產物為褐色，也沒有擴增到梯形DNA條帶。說明16株草莓感病植株中2～13號植株的病原菌是Fof, 而14～17號植株為其他病原菌。

同時，常規PCR檢測結果表明LAMP反應呈現熒光綠的草莓植株根模板會擴增出一條大小為239 bp的DNA條帶，其中2、5、6、7、8和9號病株DNA提取液中沒有擴增出條帶(圖6(b))。可能是由于DNA提取液中Fof的含量過低。

M為分子量標記；1為陽性對照，2～17為草莓患病植株的模板DNA，18為健康植株的模板DNA，19為陰性對照。M is marker; 1 is postive control, 2-17 are template DNA from diseased stems of strawberry, 18 is template DNA from healthy stems, 19 is negative control.圖6 Fof的LAMP田間檢測Fig.6 Field susceptible plants test of the LAMP assay for Fof

3 討論與結論

3.1 LAMP技術檢測草莓枯萎的可行性

由F.oxysporumf. sp.fragariae引起的草莓枯萎病是一種嚴重的土傳病害，僅通過早期癥狀難以辨認，而且癥狀一旦顯現后，病害將無法控制，所以對該病害早期快速的檢測顯得尤為重要。傳統的病原菌鑒定方法是通過組織分離法培養病原菌，對其進行PCR生物學鑒定，此法至少需要5～7 d完成，耗時過長[17]，而LAMP法從采樣到鑒定完成僅需1 d即可。LAMP檢測技術因其獨特優勢，已被廣泛用于檢測各種植物病害，Duan等[18]使用HNB-LAMP技術對番茄灰霉病進行檢測；Yang等[19]使用SYBR-Green I-LAMP實現了對梨黑斑病的快速檢測；楊帆等[20]建立了青稞黑穗病的LAMP檢測體系；Chen等[21]也是通過LAMP技術實現了對油橄欖炭疽病的快速檢測。

3.2 LAMP技術染料的選擇

LAMP反應過程會析出大量焦磷酸根離子，其與反應液中的Mg2+結合，形成乳白色焦磷酸鎂沉淀。因此，可以通過觀察反應液中是否形成白色混濁來判斷靶序列是否存在[8]，也可以向LAMP反應中添加核酸染料或金屬離子指示劑，通過反應液顏色的變化來判斷反應結果。如Katoh等[22]通過使用羥基萘酚藍(HNB)對Fof的LAMP反應液進行顯色處理，陰性反應呈紫色，陽性反應呈天藍色。而本研究則使用SYBR Green I熒光染料對LAMP反應液進行顯色處理，陰性反應呈褐色，陽性反應呈熒光綠色。與SYBR Green I熒光染料相比，HNB檢測靈敏度較高，但反應前后顯色不明顯，不利于人們進行肉眼檢測，且HNB的顯色會根據LAMP反應中添加各試劑的來源廠家不同和添加比例不同而存在差異，所以通過HNB顯色具有很強的主觀性。使用SYBR Green I熒光染料對LAMP反應進行顯色，會更加方便客觀的實現對草莓枯萎病的檢測。但由于SYBR Green I熒光染料需要在LAMP反應后添加到體系中，所以對添加染料的環境以及操作者的技術有要求，否則極易造成假陽性。

3.3 LAMP技術檢測存在的問題

LAMP特異性檢測共檢測了16種草莓上常見的病原菌以及土傳病原菌。其中膠孢炭疽菌、煙疫霉菌和擬盤多毛孢都可造成草莓致死，作為Fof的主要對照菌，而其他菌可能會在采樣過程中污染樣品，所以作為次要的區分對照菌。本研究所建立的LAMP檢測方法可以將Fof與其他15種菌區分開，其特異性滿足實際應用的需求。本研究也曾對Fof接種的土壤樣品以及枯萎病田間土壤樣品進行分別檢測，但并未檢測到Fof的存在。分析可能存在的原因：一是對土壤樣品中Fof的提取率太低；二是Fof本身屬于半活體營養型真菌，只有活體存在時才有利于Fof的增殖生存，所以土壤中病原菌很難被檢測到。在對諸多病原菌的LAMP檢測中，LAMP的檢測靈敏度往往比普通的PCR檢測高10～100倍。本研究在靈敏度檢測試驗中，由于Fof是純模板且濃度高，普通PCR檢測時長為1.5～2.0 h，而LAMP檢測時長為1.0 h，不同方法中目的片段擴增量可能存在差異，使得普通PCR檢測靈敏度與LAMP檢測靈敏度相似。而在實際的田間檢測中，2、5、6、7、8和9號病株只能被LAMP檢測到，可見LAMP檢測靈敏度仍是高于普通PCR。

綜上所述，本研究開發的LAMP檢測體系為草莓枯萎病綜合防治提供了一條新的途徑，未來還需要一種高靈敏度且可以提前檢測土壤中是否含有Fof的方法，實現對草莓枯萎病的早發現和早防治。