新疆伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化豬場病毒性腹瀉疾病檢測與分析

王傳鋒 米青婕 皮志媛

（新疆伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊犁 835000）

目前，豬場中以豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroEnteritis virus,TGEV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus,PoRV）以及豬德爾塔冠狀病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）等病毒性腹瀉性疾病較為常見，主要引起仔豬的腹瀉，成為危害養(yǎng)豬業(yè)的主要腹瀉性傳染性疾病，且在豬場中廣泛流行，其感染率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展[1,2]。而豬感染牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）后會出現(xiàn)類似慢性豬瘟感染癥狀及病理變化，引起許多消滅或控制CSF國家的高度預(yù)警，目前許多學(xué)者已逐漸關(guān)注。PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等病毒性病原，其臨床特征相似，臨床上以嚴(yán)重腹瀉、脫水和損傷仔豬的消化器官為主要特征，各階段的豬均會感染，以仔豬較為嚴(yán)重，其致死率可高達(dá)80%以上，4種病毒性腹瀉疾病在臨床中常以混合感染為多見，臨床中不易診斷，很難區(qū)分，給該病防控帶來一定困難[3,4]。目前病毒性疾病沒有有效藥物可以治療，主要通過疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防，其免疫不當(dāng)，很大可能導(dǎo)致疾病的流行與發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此，應(yīng)該注意PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等疾病的疫苗免疫和豬場的凈化，減少該病的發(fā)生與流行。

2021年從伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化豬場采集患腹瀉病豬的血液、糞便腸內(nèi)容物等病料組織1 200份，檢測5種病毒性腹瀉疾病 （PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV）感染與流行情況，為該地區(qū)腹瀉病毒性疾病綜合防控提供參考基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021年從伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化豬場采集患腹瀉病豬的血液、糞便腸內(nèi)容物等病料組織共1 200份，其中，尼勒克縣182份、新源縣192份、鞏留縣201份、特克斯縣162份、伊寧縣173份、察布查爾縣164份、霍城縣126份。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自TAKARA公司；T載體、瓊脂糖DNA回收試劑盒、DL-2 000 Maker、ExTaq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病料組織的處理

將采集糞便及腸內(nèi)容物等病料組織進(jìn)行處理，加入等量無菌的PBS中均漿，在-80℃反復(fù)凍融3～5次，離心后取上清，用0.2 μm濾紙過濾后加入1%雙抗處理0.5 h，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 核酸的提取

血液分離血清后，直接用病毒RNA提取試劑盒提取，糞便及腸內(nèi)容物等病料組織經(jīng)過處理后，參照說明書病毒RNA提取試劑盒說明分別提取血清、糞便及腸內(nèi)容物RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)與和合成

參考文獻(xiàn)[6]并參照GenBank中登錄的基因序列，設(shè)計(jì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）以及牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）等5種病原的特異性鑒定引物（引物序列具體見表1），引物由華大基因有限公司合成。

表1 5種病毒的引物序列

1.6 RT-PCR鑒定與測序

以提取病料組織的核酸為模板，分別加入合成的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5種病毒的引物，用PCR方法分別檢測其PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV陽性率（具體步驟按照RT-PCR說明書執(zhí)行）。回收陽性樣品的目的基因片段，按照說明書連接到T載體上后，提取質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測序，其測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株進(jìn)行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒RT-PCR檢測結(jié)果

以提取的病料組織的核酸為模板，用RT-PCR分別檢測PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5種病原。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV病原菌擴(kuò)增出目的條帶，分別為231 bp、342 bp、309 bp、1 100 bp、289 bp（見圖1)，選擇陽性樣品連接T載體測序，其PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株比較發(fā)現(xiàn)同源性在97.0%～99.0%之間。

圖1 病料組織的RT-PCR檢測結(jié)果

2.2 PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV、 BVDV檢測結(jié)果

利用 RT-PCR進(jìn)行 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV目的片段檢測。結(jié)果由表2可知，2021年的伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化豬場中PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV總陽性率分別為34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%。其中PEDV和PoRV陽性率較高。

表2 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV的檢測結(jié)果

2.3 PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV、 BVDV多重感染檢測結(jié)果

對2021年從伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化豬場采集的1 200份樣品，進(jìn)行PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV陽性率的多重感染率統(tǒng)計(jì)分析，由表3可知，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV等4種病原存在共感染情況，其中以二重感染為主，PEDV/TGEV和PEDV/PoRV二重感染，感染率最高，分別為7.2%、9.4%，說明該地區(qū)不同豬場中以二重感染為主。

表3 多重感染檢測結(jié)果

3 討論

豬場中病毒性腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染性疾病之一，主要通過疫苗進(jìn)行免疫，尤其是具有傳染源和疫苗免疫不合理時(shí)均可以導(dǎo)致一些病毒性腹瀉疾病的發(fā)生與流行，在流行過程中呈現(xiàn)隱性感染或者混合感染，給疾病的診斷和防控帶來一定的困難[11,12]。因此，對豬場中病毒性腹瀉疾病的凈化與綜合防控具有重要意義。本試驗(yàn)通過對2021年從新疆伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化豬場采集的病豬血液肌及組織樣品，進(jìn)行 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV等5種病毒性腹瀉病原的檢測。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、BVDV的總陽性率分別為34.5%、7.4%、22.7%、2.9%、8.2%，且以PEDV和PoRV陽性率較高，以二重感染為主，其中PEDV/TGEV、PEDV/PoRV二重感染率分別為7.2%、9.4%。說明該地區(qū)PEDV、PoRV流行率較高，可能與PEDV、PoRV 2種疫苗的免疫效果較差或者不合理有關(guān)，導(dǎo)致其陽性率較高。當(dāng)前，國內(nèi)養(yǎng)豬企業(yè)中，對PEDV、PoRV防控主要通過疫苗免疫來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)疫苗免疫也是預(yù)防該病的主要方法，此外，需要注意母豬場中疾病的凈化，防止帶毒傳播。本試驗(yàn)為該地區(qū)豬場中病毒性腹瀉性疾病的防控提供參考依據(jù)。