雙酚A 對小黃魚幼魚的急性毒性

魏福亮，謝慶平，蔚 敏，詹 煒，劉 峰，樓 寶

(1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；2.浙江省農業科學院水生生物研究所，浙江杭州 310021)

環境內分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals，EDCs)是一類影響生物內源激素正常合成和代謝，進而影響生物內環境穩態、生殖發育等正常生理活動的一類外源性化學物質[1]。EDCs 種類包括類雌激素物質、有機氯農藥和重金屬等[2]。BPA 是研究頻率最高的EDCs 之一，具有良好的耐熱性和可塑性，被廣泛應用于高分子材料的生產，如塑料水桶、水杯和食品罐內壁涂料等[3]，其結構與合成雌激素己烯雌酚相似[4]，具有雌激素活性[5]，BPA 可通過工業廢水直接排放進水體[6]，也可通過其制品殘余物和垃圾滲濾液等間接進入空氣、土壤中[7]，通過參與物質循環分散到自然環境當中。在世界范圍內的多個國家均有研究報告水體環境監測到BPA，濃度從0.05 μg·L-1至12 μg·L-1[8-11]，我國近岸檢測到的BPA 濃度最高達到1.4 μg·L-1[12]。BPA 能由食物鏈進入生物體內并與雌激素受體(ER)相互作用，干擾正常激素在機體內的產生、釋放、運輸、代謝等作用，從而影響生物的生殖、神經、免疫神經系統等功能[13-14]，也可通過阻礙激素與受體結合，進而阻斷激素信號傳遞引起功能喪失[15]。已有研究結果表明，BPA 攝入會導致男性精子數量降低，提高內分泌異常相關疾病(女性青春期提前等)[16]、肥胖[17]和癌癥的發病率[18]，在母體中積累會導致早產，提高胎兒畸形率[19]。在魚類中，對BPA 的研究主要集中在對魚類的毒性致死作用和對魚類生殖系統的破壞性[20]。已有BPA 的急性毒性實驗報道，BPA 對體長3.0±0.5 cm 的斑馬魚Danio rerio 96 h 急性毒性暴露的半致死濃度為6.3 mg·L-1[21]；對大西洋銀漢魚Menidia menidia 的96 h 急性毒性半致死濃度為9.4 mg·L-1[22]。另一方面，低濃度BPA 長期浸浴導致雄性斑馬魚性腺成熟度以及成熟精子數顯著下降[23]，雌性斑馬魚的產卵量顯著下降，且子代畸形率升高[24]；同樣，也會導致雌性鯉魚Cyprinus carpio 閉鎖卵泡數增多，雄性鯉魚精巢小葉結構減少[25]；對比目魚Paralichthys olivaceus 用100 μg·kg-1含有BPA 的飼料投喂，會誘導群體出現雌性化[26]。

小黃魚Larimichthys polyactis，又名小鮮、黃花魚等，隸屬于鱸形目Perciformes，石首魚科Sciaenidae，黃魚屬Larimichthys，是我國“四大海產”之一[27]，小黃魚全人工繁養殖技術[28-29]的成功為保護小黃魚種質資源，研究各種因素對小黃魚的影響機制提供了保障。已有研究表明，小黃魚在孵化后43～80 d 期間，雄性性腺中會先出現卵母細胞，而后凋亡退化，這一特殊的性腺發育模式被認為主要受遺傳因素影響，但不能完全排除環境因素參與影響的可能[30]。在小黃魚性別分化起始之前，通過長時期暴露外源17β-雌二醇(17βestradiol，E2，一種天然的雌激素)，雄性主要表現為精巢發育受阻，卵母細胞未能出現數量上的增加。證明外源E2 并不是導致小黃魚雄性雌雄同體階段產生的原因[31]。另一方面，調查顯示BPA 是我國沿海含量最高的環境內分泌干擾物，在我國近海沿岸海域濃度可達到1.4 μg·L-1[12]，其環境中的含量遠高于E2。因此，研究BPA 對小黃魚生長和性腺發育的影響，對解釋其特殊性腺發育模式的產生原因，保護小黃魚野生資源具有重要意義。

由于BPA 對生物具有毒性作用，因此在進行相關研究時需要首先明確BPA 對研究對象的半致死濃度和安全濃度。本研究通過對孵化后25 d 的小黃魚進行96 h 急性毒性實驗，得到BPA 對小黃魚的半致死濃度和安全濃度，對后續的相關研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用代小黃魚是浙江省農業科學院水生生物研究所象山港灣水產苗種有限公司養殖基地2021年繁殖培育的F7 代苗種，孵化后，養殖條件為水溫17～20 ℃，鹽度22～25，自然光照周期，孵化后4～15 d分別投喂輪蟲和小球藻，孵化后12～22 d 投喂鹵蟲無節幼體，第16 d 開始使用商業飼料投喂馴化，至孵化后22 d 左右完成顆粒飼料馴化，每日投喂3 次。小黃魚養至孵化后25 d 用于實驗。實驗魚提前8 h 停止投喂，并轉入總容積1 000 L 的表面光滑的藍色玻璃鋼水桶，實驗開始后第48 h 投喂少量鹵蟲。動物實驗按照浙江省農業科學院實驗動物管理和使用委員會批準的《實驗動物管理與使用指南》的規定進行。

1.2 實驗用水中BPA 濃度的檢測

為探明本研究實驗用養殖水體BPA 水平，在BPA 浸浴實驗前，從實驗桶中隨機抽取3 個樣本的砂濾海水，各50 mL，分別標記為A、B、C，置于-20 ℃條件下保存備用。

采用液質聯用法對實驗用水中的BPA 濃度進行檢測。實驗方法如下:(1)稱取BPA 固體，用含0.1%甲酸的甲醇配制為2 mg·mL-1的母液備用。用甲醇將BPA 母液稀釋為2.0 μg·L-1濃度的標準溶液。(2)取水樣加入0.1%氨水/甲醇溶液高速離心取上清。(3)液相色譜進樣，質譜檢測，完成數據采集。

1.3 BPA 浸浴急性毒性實驗

在0～5 mg·L-1之間設計濃度梯度0、0.1、0.5、1.0、2.5、3.0、3.3、3.5、3.8、4.0、4.5、5.0 mg·L-1以及無水乙醇對照組(Control)各1 桶，對孵化后25 d 的小黃魚進行急性毒性浸浴實驗。實驗進行時實驗桶水量為500 L，水溫17～20 ℃，鹽度22～25，溶氧量8.5～10.5 mg·L-1，pH=8.05±0.05，持續曝氣，在自然光照周期下浸浴96 h。根據所設浸浴濃度梯度，配制工作液，準確稱量BPA 固體(Sigma，德國，CAS：80-05-7，≥97%)，以無水乙醇為溶劑配制工作液(表1)。

表1 BPA 工作液的配制方法Tab.1 Preparation method of BPA working fluid

各浸浴濃度梯度組實驗同時進行，每桶小黃魚178～335 尾，提前8 h 從表面光滑的水泥池轉移到藍色玻璃鋼水桶中并停止投喂，各浸浴組及Control 組分別加入10 mL 工作液，0 mg·L-1組不做處理，96 h 浸浴過程中不換水，由于實驗濃度梯度較為密集，因此未設置平行對照，且因為實驗魚較小，為避免其因饑餓死亡，在實驗進行至48 h 時適量投喂鹵蟲。

1.4 存活率統計

因小黃魚對光線刺激敏感，使用光線刺激即可判斷，所以未采用針刺法[32]。用強光照射后10 s 內無反應，即判定為死亡。實驗過程中，每隔2 h 觀察記錄實驗魚是否出現身體不平衡、游動緩慢等中毒癥狀、并記錄死亡數量及時撈出死魚。實驗結束后，清點每組小黃魚剩余量，計算每組小黃魚總量。最后通過死亡數量和存活數量計算出存活率。

1.5 數據分析

數據使用SPSS 23.0 統計軟件中文版處理。建立樣本總數、浸浴濃度和存活率3 個變量，選擇分析-回歸-概率，分別計算并獲得24 h、48 h、72 h 和96 h 半致死濃度(LC50)，并根據以下經驗公式計算安全濃度。

式中:SC 為安全濃度(safe concentration)，mg·L-1；LC50為半致死濃度，mg·L-1。

2 實驗結果

2.1 液質聯用法檢測實驗用水中的BPA 水平

通過液質聯用方法定量檢測A、B、C 3 個水樣的總離子流圖結果顯示，標準品的峰值在3.31 min 出現(圖1A)，樣品A 的峰值出現在4.45 min(圖1B)，樣品B 的峰值出現在4.44 min(圖1C)，樣品C 的峰值出現在4.41 min(圖1D)。檢測樣本峰值出現時間與標準品峰值出現時間差別顯著，而各標準品之間峰值出現時間接近。結果表明實驗進行時所用海水未檢測出BPA。

圖1 標準樣和實驗用水樣中BPA 的總離子流圖譜Fig.1 Total ion current spectrum of BPA in standard and experimental water samples

2.2 中毒癥狀

為避免潛在應激作用的影響，實驗魚提前8 h 移入實驗桶中適應環境。各實驗組在加入BPA 工作液時，實驗魚立即出現反應，表現為迅速游向桶壁，做無規則游動，浸浴濃度越高，反應越強烈。此現象持續5 min 左右。0 mg·L-1組正常游動無異常，無水乙醇組有輕微應激反應，持續時間非常短。瀕臨死亡的小黃魚行動遲緩，用強光刺激后反應遲鈍，身體出現變形，泳姿為傾斜狀，泄殖孔處有白色絲狀異物，死后身體形態扭曲，一般沉入桶底或浮于桶壁周圍。

2.3 急性毒性特征分析

統計不同浸浴濃度在24、48、72 和96 h 的存活率，實驗結果表明，0 mg·L-1和Control 組出現個別死亡，且死亡狀態與中毒癥狀不符。在對實驗中24、48、72 和96 h 小黃魚存活率的計算后發現，浸浴24 h后，0～4.0 mg·L-1濃度范圍內，小黃魚的存活率都在90%以上，而4.5 mg·L-1濃度組和5.0 mg·L-1濃度組的存活率出現了明顯的下降，分別下降到69.26%和14.03%；浸浴48 h 后，0～3.3 mg·L-1濃度范圍內的存活率依然在90%以上，3.5～5.0 mg·L-1濃度范圍內存活率出現了明顯下降，5.0 mg·L-1濃度組的小黃魚全部死亡；浸浴至72 h 和96 h 的結果相似，即0～2.5 mg·L-1范圍內，小黃魚存活率處于較高水平，即使最低存活率也高達96.73%，3.00 mg·L-1時迅速由2.5 mg·L-1的98.04%下降到81.25%，之后隨浸浴濃度升高，小黃魚存活率下降，濃度達到5.0 mg·L-1時，小黃魚全部死亡(表2)。

表2 小黃魚在不同濃度BPA 中各時間段的存活率Tab.2 Survival rate of L.polyactis exposure to different concentrations of BPA at each time point

對小黃魚96 h 不同濃度的BPA 浸浴存活率進行分析，結果表明，小黃魚的存活率隨浸浴濃度的升高大致可分為2 個階段，即0～2.5 mg·L-1濃度范圍的緩慢變化階段和2.5～3.0 mg·L-1濃度范圍的快速下降階段(圖2)。

圖2 不同濃度BPA 暴露96 h 后小黃魚的存活率曲線Fig.2 Survival rate curve of L.polyactis exposure to different concentrations of BPA after 96 h

因此以2.5 mg·L-1為界限，分別對0～2.5 mg·L-1和2.5～5.0 mg·L-1范圍存活率進行分析。2.5 mg·L-1以內，存活率高，且折線分布于0 mg·L-1組兩側，下降趨勢較緩(圖3A)，當暴露濃度大于2.5 mg·L-1時，存活率下降趨勢隨濃度的提高而增加，且濃度在4.5 mg·L-1時存活率又出現了更加明顯的下降(圖3B)，即濃度越高，存活率下降趨勢越明顯。

圖3 不同濃度BPA 在各時間段對小黃魚存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of BPA exposure at each time point on the survival rate of L.polyactis

2.4 半致死濃度和安全濃度

根據表1 所統計的存活率，使用SPSS 23.0 軟件進行概率分析，分別得到24、48、72 和96 h 的半致死濃度為4.68、4.29、4.09 和3.94 mg·L-1，并通過經驗公式算得安全濃度為1.08 mg·L-1(表3)，隨實驗時間增加，半致死濃度降低，說明BPA 毒性在小黃魚體內有蓄積作用，且隨暴露濃度升高，蓄積作用越明顯。

表3 小黃魚BPA 暴露的半致死濃度和安全濃度Tab.3 The semi-lethal concentration and safe concentration of BPA exposure in L.polyactis

小黃魚作用的安全濃度與對小黃魚存活率的分析結果一致，而在2.5 mg·L-1濃度組小黃魚的存活率依然高達98.04%，說明在此范圍內，雖然已經超出安全濃度，但此范圍的毒性蓄積作用并不明顯，而此后存活率大幅度下降，表明此后的毒性蓄積作用增強，對小黃魚的毒性作用更加明顯，因此BPA 的毒性與濃度為非直線關系[33]。

3 討論

3.1 BPA 對生物的影響

本實驗對0～5.0 mg·L-1濃度范圍內BPA 對小黃魚存活率的影響做了詳細研究，統計了不同濃度BPA暴露后，小黃魚在不同時間段的存活率，通過SPSS 23.0 數據軟件的分析和公式計算，我們獲得了各時間段的半致死濃度以及安全濃度，結果表明，對孵化后25 d 的小黃魚，BPA 的安全濃度為1.08 mg·L-1，說明在2.5 mg·L-1濃度范圍以內，小黃魚對BPA 的具有高度的耐受性。

隨著工業的發展和塑料制品的廣泛應用，BPA 污染分布范圍遍布環境各個角落。理論上，BPA 的生物半衰期約為6 h，可以通過尿液排出體外，但仍然會有一部分BPA 會積累在組織當中[34]。由于其廣泛的分布，且具有化學毒性，因此會對各種生物產生不同程度的影響。人類耐受的BPA 的安全劑量為≤50 μg·(kg·d)-1[35]。學齡前兒童對BPA 的耐受力相對成年人要低，因此學齡前耐受的安全劑量為0.24～0.41 ng·(kg·d)-1[36]。歐洲和美國食品、藥物管理局認為目前環境中BPA 的暴露并不能對人體產生損害[35]。但是部分科學家卻認為，環境中的BPA 水平可能足以危害人類健康，且由于胎兒各項生理機能并未成熟，因此即使是微量的BPA 接觸，也可能對胎兒產生不良影響[37]；0.1 mg·L-1濃度BPA 處理72 h 后會影響5 齡第4 天家蠶無核精子束的形成及精子束的濃縮成熟[38]；通過對SD 大鼠Sprague-Dawley，用于藥理、毒理、藥效及GLP 實驗的一個大鼠品系進行BPA 灌胃發現，BPA 會影響大鼠機體的免疫功能[39]；使用12.5、25 和50 mg·(kg·d)-1的BPA 對雌性CD-1 小鼠進行腹腔注射后，結果顯示高濃度的BPA 會抑制卵泡的發育[40]；BPA 濃度達到0.79 mg·L-1會對河蜆Corbicula fluminea 產生氧化損傷[41]；在對金魚Carassius auratus 的研究中發現，0.05和0.5 mg·L-1濃度的BPA 浸浴30 d 后，金魚精巢發育受到阻礙，且停止暴露后，精巢仍無法繼續發育成熟[20]；0.02 mg·L-1濃度的BPA 暴露3 周后會改變雄性和雌性斑馬魚的內分泌大麻素系統(ECS)，從而改變性腺功能[42]；從出生開始分別使用0.375 和1.5 mg·L-1的BPA 暴露斑馬魚至性成熟，會導致斑馬魚性腺組織形態結構改變，交配行為障礙，雌性產卵量下降[43]；分別使用5.4、6.0、6.8、7.6、8.0 mg·L-1的BPA 處理斑馬魚96 h，會導致雄性斑馬魚精巢結構損傷，雌性斑馬魚卵泡嚴重萎縮[44]。

目前對雙酚A 暴露的研究主要集中在生殖毒性方面。在對小黃魚的研究過程中發現，小黃魚雄性精巢在發育過程中會經歷特殊的雌雄同體階段[30]，BPA 又是我國沿海含量最高的環境內分泌干擾物，因此研究BPA 對小黃魚的影響對此特殊階段產生原因的解析有重要意義。

3.2 BPA 毒性特點

本研究結果顯示，BPA 對小黃魚的致死作用并不是隨濃度增加而單純的呈直線增強，而是會經歷不同的毒性強度階段，隨時間的推移和暴露濃度的增加，BPA 在小黃魚體內的蓄積作用越來越明顯。這與BPA 毒性作用曲線呈“U 型”的結論相似[45]。

而且在研究中發現，BPA 的毒性出現了比較明顯的分段。首先，實驗各時間段半致死濃度比較結果為24 h LC50>48 h LC50>72 h LC50>96 h LC50，說明隨時間的推移，BPA 在小黃魚體內的毒性蓄積作用愈發明顯，當BPA 含量超出小黃魚耐受范圍時，小黃魚存活率出現快速下降。通過計算，其安全濃度為1.08 mg·L-1，而0～2.5 mg·L-1濃度范圍的存活率普遍較高，說明在1.08～2.5 mg·L-1范圍內，雖然已超出安全濃度，但其毒性仍較低，原因可能是在此范圍內，BPA 的蓄積作用仍在小黃魚正常代謝調控限度之內，小黃魚可以通過自身代謝來降低BPA 造成的損傷，因此這時小黃魚的存活率仍然較高。而濃度達到3.0 mg·L-1時，存活率出現了明顯的下降，此時的濃度跨度為0.5 mg·L-1，遠低于安全濃度與2.5 mg·L-1之間的跨度，說明此時BPA 的蓄積作用顯著，導致毒性作用快速增強。本研究實驗結果及計算分析表明，小黃魚BPA 暴露96 h 半致死濃度為3.94 mg·L-1，與其他水生生物略有差異，例如BPA 對黑斑蛙Pelophylax nigromaculatus 胚胎的半致死濃度為7.68 mg·L-1，對黑斑蛙蝌蚪的半致死濃度為9.00 mg·L-1[46]；對體長3.0±0.5 cm 的斑馬魚的96 h 急性毒性暴露的半致死濃度為6.3 mg·L-1[21]；對大西洋銀漢魚的96 h 急性毒性暴露的半致死濃度為9.4 mg·L-1[22]。

綜上所述，高濃度的BPA 對孵化后25 d 的小黃魚具有急性毒性作用，當暴露濃度大于2.5 mg·L-1時BPA 在小黃魚體內蓄積作用增強，致死作用顯著，并隨暴露時間延長和暴露濃度提高而增強。結果顯示，與其他物種相比，小黃魚對BPA 的耐受力較弱，因此BPA 更容易對小黃魚的生長生殖等生理活動產生影響。本研究確定了BPA 對小黃魚的半致死濃度和安全濃度，為接下來研究BPA 對小黃魚性腺發育的影響提供數據基礎，豐富了BPA 對海洋生物毒性作用的研究結果，為研究BPA 對其他生物的毒性作用提供參考。