基于高通量測序技術的海洋魚類定性和定量分析

張浩博，陳建威，徐大有，高天翔，王曉艷

(1.浙江海洋大學國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.青島華大基因研究院，山東青島 266555；3.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022)

隨著現代分子生物學的發展和高通量測序技術的成熟，高通量測序技術以其對生物物種鑒別具有高效、簡便、客觀等特點，已被廣泛應用于水生生物的鑒定和多樣性評估。新興的環境DNA metabarcoding 技術將DNA 條形碼和高通量測序技術相結合，對提取的環境DNA(environmental DNA,eDNA)使用通用引物擴增并進行高通量測序，所得到的可操縱分類單元(operational taxonomic units，OTUs)與物種數據庫比對獲得物種信息，從而進行物種多樣性分析[1-2]。環境DNA metabarcoding 由于高靈敏度、快速高效以及對生物無損傷等優勢，被廣泛應用于水生生物多樣性監測，逐漸成為物種監測的重要工具[3-4]。然而在實際應用中，污染、引物偏好性[5]、腐殖酸抑制[6]、假陽性[7]、假陰性[8]以及數據庫不完善[9]等問題都可能會對最終結果造成一定的影響，因此高通量測序的結果是否能夠準確反應物種生物量和豐度尚不明確。

大黃魚Larimichthys crocea 屬鱸形目Perciformes、石首魚科Sciaenidae、黃魚屬Larimichthys，曾是我國四大海產之一，由于過度捕撈、生境惡化等原因，大黃魚資源接近枯竭[10]。花鱸Lateolabrax maculatus 屬鱸形目Perciformes、花鱸科Lateolabracidae、花鱸屬Lateolabrax，為東北亞特有種，俗稱鱸魚、七星鱸等，在我國沿海各省廣泛養殖[11]。黑鯛Acanthopagrus schlegelii 屬鱸形目Perciformes、鯛科Sparidae、棘鯛屬Acanthopagrus，俗稱海鮒、黑加吉、銅盆魚等，是我國沿海各省理想的增殖放流種類[12]。褐菖鲉Sebasticus marmoratus 屬鲉形目Scorpaeniformes、鲉科Scorpaenidae、菖鲉屬Sebastiscus，是近海常見的巖礁性卵胎生魚種[13-14]。眼斑擬石首魚Sciaenops ocellatus 屬鱸形目Perciformes、石首魚科Sciaenidae、擬石首魚屬Sciaenops，俗稱美國紅魚，原產于美國大西洋沿岸和墨西哥灣，1991 年由國家海洋局第一海洋研究所引進，但在其養殖過程當中，因美國紅魚逃逸而成為入侵魚種[15-16]。2004 年6 月至2006 年10 月，在浙江沿海捕獲了156 個總長度超過45 cm 的標本[16]。眼斑擬石首魚可能會成為世界上第3 個海洋魚類入侵的例子[17]。本研究分別將這5種海水魚類的肌肉和DNA 按照一定比例混合，探究高通量測序所得各魚種reads 數、肌肉樣品質量以及DNA 濃度的關系，不僅為高通量測序技術用于海水魚類定性鑒定分析提供技術支持，同時可為今后用于環境DNA metabarcoding 技術進行物種生物量評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取5 種海水魚類，分別為:大黃魚、花鱸、黑鯛、褐菖鲉和眼斑擬石首魚，充氧帶回實驗室，暫養3 d。使用丁香酚麻醉，處死后取肌肉(統一選取左側背部肌肉)。

1.2 肌肉和DNA 正交試驗設計

按照表1 肌肉和DNA 比例分別進行2 組正交試驗。

1.3 肌肉混合實驗

將5 種魚類的肌肉按照表1 正交梯度比例進行混合，混合好的各組樣品采用標準的苯酚-氯仿方法分別提取DNA 并混勻，記為Muscle 組。

表1 基于正交試驗的肌肉與DNA 正交梯度混合表Tab.1 Muscle and DNA gradient mixing table based on orthogonal experiment

1.4 DNA 混合實驗

稱取5 種魚的肌肉組織各2 g，提取DNA，Nanodrop 測定各樣品DNA 的濃度。將DNA 樣品按照表1各組實驗的比例混勻，記為DNA 組。

1.5 信息注釋與統計分析

將混合好的各組樣品，使用通用引物MiFish-U-F：GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC 和MiFish-U-R：CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG[1]擴增建庫，MGISEQ-2000 平臺進行高通量測序。拼接的reads 經過優化后，每個樣品截取25 000 條拼接后的reads，利用UPARSE 在97%相似度下進行聚類，得到OTU(operational taxonomic units)的代表序列。將聚類得到的OTU 去除嵌合體后統計每個樣品中每個OTU 的豐度信息，并用于后續物種分類。使用Blast+(v2.2.31) 將OTU 代表序列與NCBI NT 數據庫比對，進行物種注釋，比對閾值設置為“E-value＜1e-5,identity>99%,coverage>95%”。

使用R(v4.0.3)對數據進行處理分析，線性擬合使用“basicTrendline”包，使用“ggplot2”包，“pheatmap”包進行繪圖。對肌肉混合實驗豐度結果和DNA 比例實驗豐度結果進行單因素方差分析。

2 實驗結果

2.1 測序結果

2.1.1 肌肉混合實驗測序結果

肌肉混合實驗所有樣品共得到5 個OTU(表2)，392 738 條reads。其中OTU 1 為大黃魚，共72406 條reads；OTU 2 為花鱸，共110 623 條reads；OTU 3 為黑鯛，共98 121 條reads；OTU 4 為褐菖鲉，共53872 條reads；OTU 5 為眼斑擬石首魚，共57 716 條reads。各肌肉混合實驗組OTU 相對豐度見圖1。

圖1 肌肉混合實驗各物種相對豐度Fig.1 Relative abundance of each species in muscle mixing experiment

表2 肌肉混合實驗各OTU 相對豐度Tab.2 OTU relative abundance in muscle mixing experiment

2.1.2 DNA 混合實驗測序結果

DNA 混合實驗所有樣品共得到5 個OTU(表3)，395 679 條reads。其中OTU 1 為大黃魚，共82 961 條reads；OTU 2 為花鱸，共102 769 條reads；OTU 3 為黑鯛，共99 439 條reads；OTU 4 為褐菖鲉，共48 962 條reads；OTU 5 為眼斑擬石首魚，共61 548 條reads。各DNA 混合實驗組OTU 相對豐度見圖2。

圖2 DNA 混合實驗各物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of each species in DNA mixing experiment

表3 DNA 混合實驗各OTU 相對豐度Tab.3 OTU relative abundance in DNA mixing experiment

2.2 OTU 聚類分析結果

統計每個樣品在每個OTU 中的豐度信息，36 個樣品共得到5 個OTU，分別對應實驗選取的5 種海水魚類，無其他魚種污染。肌肉比例組和DNA 比例組檢測到的物種豐度情況如圖3 所示。多數混合比例相同的DNA 組和Muscle 組聚為一類，僅有少數組別與其混合魚種比例相近的小組聚類(圖4)。

圖3 各實驗組物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of species in each experimental group

2.3 肌肉混合實驗相關性分析

以肌肉比例為橫坐標，高通量測序結果注釋的各OTU reads 數為縱坐標，繪制肌肉比例與高通量測序reads 數的函數關系，高通量測序的reads 數與魚類肌肉占比呈一致變化的趨勢(圖5)，reads 數與魚類肌肉占比均呈顯著線性關系(OTU 1：R2=0.90,P＜0.01;OTU 2：R2=0.75,P＜0.01;OTU 3：R2=0.47,P＜0.01;OTU 4：R2=0.70,P＜0.01;OTU 5：R2=0.68,P＜0.01)。

圖5 各OTU 肌肉比例與reads 數關系Fig.5 The relationship between the muscle ratio of OTUs and the number of reads

2.4 DNA 混合實驗相關性分析

繪制魚類DNA 比例與高通量測序reads 數的函數關系，reads 數與魚類DNA 占比也呈一致變化的趨勢(圖6)，序列reads 數與魚種占比呈顯著線性關系(OTU 1：R2=0.92,P＜0.01;OTU 2：R2=0.56,P＜0.01;OTU 3：R2=0.64,P＜0.01;OTU 4：R2=0.71,P＜0.01;OTU 5：R2=0.62,P＜0.01)。

圖6 各OTU DNA 比例與reads 數關系Fig.6 The relationship between the proportion of OTU DNA and the number of reads

3 討論

3.1 高通量測序技術定性檢測的準確性

高通量測序技術的發展極大地推動了DNA 宏分類學(DNA metasystematics)的發展[18]。傳統的水生生物調查耗時費力[19-20]、成本高[19,21]，且高度依賴于研究人員的分類學知識[2,22]，而基于高通量測序的DNA metabarcoading 方法具有高效、低耗、高精度以及操作方法簡單等優點，可以彌補傳統調查方法的不足[23]。近年來，基于高通量測序的環境DNA metabarcoading 技術已應用于水生生物監測的研究和應用中，逐漸成為水生生物監測的重要手段。研究者利用水體中的DNA 對海洋中魚類群落進行了評估[24]，通過高通量測序的結果繪制了海洋和淡水魚種群豐度隨時間(月份)變化的時序圖[25]，使DNA metabarcoading 技術成為魚類鑒定、洄游、群落評估等相關研究的便利工具。此外，魚類發育過程中存在同種異形和異種同形以及變態等諸多復雜多樣的現象，許多魚類的早期發育過程極其相似，導致了稚魚分類鑒定難度較大，加劇了傳統形態學分類鑒定的困難，高通量測序技術為解決這些難題提供了重要保障[26]。本研究中高通量測得的數據與實際進行混合的魚種一致，5 種魚類均被檢出的同時沒有其他污染，聚類產生的5 個OTU 分別對應了大黃魚、黑鯛、花鱸、眼斑擬石首魚以及褐菖鲉，體現了高通量測序在定性檢測方面的準確性。

高通量測序技術在定性方面的應用廣泛，THOMSEN,et al[27]利用高通量測序技術在水體中提取的DNA成功地檢測到了5 種歐洲瀕危水生生物。VALENTINI,et al[28]對稀有種和隱蔽種進行陽性檢測，證明了高通量測序是快速了解水生生態系統物種組成最有效的工具。LIM,et al[29]使用eDNA metabarcoading 方法在城市的水庫中發現了一種入侵蝸牛—鋸齒冠螺Serrated crownsnail，并且提供了一種罕見的本土魚類—大嘴虎溪魚Pseudogobiopsis oligactis 存活的證據。在沿海魚類群落結構的評估結果中，YAMAMOTO,et al[30]發現與水下目測普查相比高通量測序可以檢測到更多難以用肉眼觀測到的本土魚類。可以看出高通量測序技術不僅可以用于檢測本研究使用的常規且較為普遍的經濟魚種，對于瀕危種、入侵種和隱蔽種也可以進行良好的定性檢測。

我國擁有大量的海洋魚類資源，這其中包括已發現的物種與未被發現物種或隱存種。高通量測序技術可以快速鑒定物種，在海洋魚類物種的定性分析方面實現了信息化和精確化，有助于及時發現稀有、珍貴的魚種和入侵種，加速對海洋生物多樣性的認知，提升對海洋生物資源的監測、保護以及利用能力。

3.2 高通量測序技術定量檢測的可靠性

高通量測序技術不僅有助于對物種多樣性的認識，還對物種生物量評估的研究提供了有力工具。研究表明高通量測序各物種reads 數隨該物種生物量增加而增加[24,31-33]，而且與魚類相對豐度之間有很好的相關性[9,34]。例如:H?NFLING,et al[9]對英國3 個湖區進行了魚類多樣性分析，將各個魚種reads 數和豐富度與長期刺網調查數據進行了對比，發現基于高通量測序技術的環境DNA metabarcoding 方法在魚類定性與定量分析均有可靠性。GOUTTE,et al[32]對法國馬恩河和塞納河的魚類結構組成進行了分析，發現這種基于高通量測序的方法所得到的結果與14 年來電魚調查效率相差無幾，而且測序所得的各個物種的相對豐度與傳統調查中該物種的相對豐度一致。本研究通過對5 種海洋經濟魚類肌肉和DNA 進行梯度混合，進行高通量測序，發現5 種海水魚類的DNA 和肌肉占比與高通量測序的reads 數均呈線性函數相關關系，這與EVANS,et al[31]的研究結果一致。對于不同的DNA 或肌肉比例，魚類的豐度變化與其DNA 或肌肉比例的變化一致，但在具體的OTU 豐度值上還有所差異，而各OTU 在肌肉混合實驗和DNA 混合實驗物種豐度的結果中并沒有表現出差異(OTU 1 ∶P=0.900；OTU 2 ∶P=0.860；OTU 3 ∶P=0.719；OTU 4 ∶P=0.968；OTU 5 ∶P=0.487)。整體來看，肌肉比例和DNA 比例與物種豐度均有對應的關系。對于相同比例的DNA 和肌肉混合豐度，其檢測到的物種豐度變化具有一致性。在物種豐度熱圖中多數比例相同的樣品聚為一組，少數同比例的肌肉和DNA 樣品以及比例相近的樣品聚為一組，證實了高通量測序技術應用于海水魚類多樣性和定量分析具有可靠性。

高通量測序技術為水生生物多樣性和相對定量研究帶來信心[35-36]，但在實際應用中，污染、引物偏好性[5,37]及假陰性和假陽性[7-8]都可能會對測序結果的準確性造成一定的影響。在實驗過程中，可以進行添加去抑制劑、使用多對通用引物和增加測序重復次數等操作以提升測序結果的準確性。雖然本研究證實了高通量測序技術在5 種海水魚類定性檢測和定量分析方面都具有可行性。但就目前來看，該技術只能作為傳統水生生物調查的補充，而不能作為獨立的監測方法[38-39]。隨著數據庫的完善和更為適宜的分子標記的發現和優化，基于高通量測序的環境DNA metabarcoading 技術將有望成為水生生物監測的主要手段。