煙草疫霉菌環介導等溫擴增檢測方法的開發與應用

李江林 李宏江 李昊熙

（貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質重點實驗室，貴州貴陽 550025）

煙草黑脛病由煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起[1]，主要危害煙草的根和莖基部，致使維管束組織壞死，最終導致煙株萎蔫枯死。煙草黑脛病發病率高、危害嚴重，在我國大部分煙草種植區均造成重大經濟損失，是困擾煙草生產的主要病害[2]。更為重要的是，煙草疫霉菌產生的病殘體可以在煙田土壤中存留若干年，導致黑脛病非常頑固，防控措施效果有限，極大地增加了病原菌檢測工作的難度[3]。環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification assay，LAMP）是一種利用目標基因設計4條特異性引物，在恒溫條件下實現大量擴增靶標的新方法[4]。該方法可以在恒溫條件下快速高效地檢測病原菌，目前已經在青枯病[5]和柑橘線蟲病[6]等土傳性病害中得到應用。經過鑒定，煙草疫霉菌對煙草的致病因子為煙草疫霉菌特有的半胱氨酸蛋白酶[7]，可以作為該種病原菌鑒定的目標基因。本研究針對煙草疫霉菌特有的致病因子半胱氨酸蛋白酶，設計了一套LAMP檢測方法，并在反應條件上進行了簡化，目的是為基層煙葉站等機構建立煙草黑脛病的快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 LAMP反應引物的設計

根據Zhang等[7]開展的煙草疫霉菌致病因子對煙草侵染發病的相關試驗結果，選取該病原菌具有明顯致病作用的半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45作為檢測體系的靶標位點。從GenBank的數據庫中下載煙草疫霉菌菌株INRA-310的PpCys45完整基因序列，該段序列全長1 068 bp，對應的序列號為XM_00 8906602.1。以這段PpCys45基因的序列為模板，在LAMP 引物設計軟件 PrimerExplorer V5（http：//primer explorer.jp/e/）中設計反應引物。選擇ΔG最低的一組4條反應引物到檢測體系中，選取的4條引物序列如表1所示。由生工生物工程（上海）股份有限公司按照序列合成4條引物后，將引物配制成濃度為10 μmol/L的溶液，供后續檢測反應使用。

表1 針對煙草疫霉菌PpCys45基因的環介導等溫擴增檢測引物

1.2 煙草疫霉菌DNA的檢測

在貴州省貴陽市開陽縣宅吉鄉和畢節市大方縣六龍鎮的煙草種植區采樣取得感染煙草黑脛病的煙株樣品各1個，命名為樣品Z和樣品L。剖開感病煙株，從發病部位與健康木質部的交界處挑取煙株組織若干，置于配制好的V8培養基（配方為V8混合果汁 100 mL、瓊脂粉 20 g、碳酸鈣 2.5 g）表面，分離煙草疫霉菌菌株。培養基在25℃條件下培養48 h后，挑取一小塊從煙株組織生長出的灰色菌絲，置于另一個配制好的V8培養基上表面，在25℃條件下繼續培養，得到煙草疫霉菌菌株的純培養，該純培養保存在貴州大學煙草學院實驗室供后續使用。使用Ezup柱式超級植物基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司生產），從保存的純培養中提取菌株的DNA，用于后續檢測反應。

利用Loopamp?朗報?脫氧核糖酸擴增試劑盒（榮研生物科技中國有限公司生產）與合成并配制到相應濃度的4條引物，對提取得到的菌株Z、L的DNA進行煙草疫霉菌LAMP檢測反應，利用熒光目視檢測試劑（FD，榮研生物科技中國有限公司生產）顯示反應結果。LAMP反應在200 μL的透明PCR管中進行，反應體系的總體積為25 μL，分別包含各個菌株的DNA提取物2 μL，以及試劑盒中包含的其他反應試劑和引物，反應量如表2所示。檢測反應利用無菌水作為空白對照。

表2 針對煙草疫霉菌PpCys45基因的環介導等溫擴增檢測反應試劑和引物用量單位：μL

將配制好反應體系的PCR管在60℃條件下反應60 min之后，在80℃條件下再反應5 min來終止環介導的進行。相關的恒溫反應在PCR儀（型號為Biometra Tone 96G）中進行。反應結束后直接觀察PCR管內熒光變化。

1.3 感染黑脛病煙株組織的檢測

在貴陽市開陽縣楠木渡鎮采樣取得感染黑脛病的煙株樣品1個。該樣品的癥狀如圖1所示，表現為煙株莖基部發黑壞死，根部萎蔫，根毛大部分脫落；用刀片縱向剖開煙株的莖基部，還可以觀察到明顯的木質部感病組織脫水，皺縮成碟片狀。

利用Loopamp?朗報?脫氧核糖酸擴增試劑盒與合成并配制到相應濃度的4條引物，對感染黑脛病煙株的根部組織（編號G）和莖基木質部組織（編號J）直接進行煙草疫霉菌LAMP檢測，不再提取DNA。挑取一小段感病根部尖端組織用于直接檢測根部煙草疫霉菌（G），挑取小片木質部碟片狀感病組織用于直接檢測莖基木質部病原菌（J）。將挑取的根部組織（G）和莖基木質部組織（J）轉移到PCR管中，按照表2的試劑量加入各種反應試劑和4條引物開展后續反應，利用熒光目視檢測試劑顯示反應結果。直接檢測反應利用無菌水作為陰性對照，利用前一步驟提取的菌株Z的DNA作為陽性對照。

將感病組織、配制好的試劑與引物反應體系的PCR管直接在電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司生產）中反應60 min（60℃），之后再在約80℃的熱水中反應5 min來終止環介導進行。反應結束后直接觀察PCR管內熒光變化。

2 結果與分析

2.1 煙草疫霉菌DNA的檢測結果

從貴陽市和畢節市的烤煙種植區采樣取得的煙草疫霉菌菌株Z和L的DNA經過LAMP反應的熒光檢測結果如圖2所示。利用擴增試劑盒和設計的4對引物，在PCR儀中進行LAMP 60℃反應60 min，菌株Z和L的DNA可以在該反應體系條件下發生反應并產生綠色熒光，反應結果能夠被肉眼觀察到。空白對照無菌水加上相同的試劑和引物，在相同的反應條件下不能發生反應，也就不能產生熒光。

2.2 感染黑脛病煙株組織的檢測結果

感染黑脛病的煙株組織直接LAMP檢測結果的熒光反應結果如圖3所示。經過在水浴鍋中60℃LAMP反應60 min，從貴陽市烤煙種植區采集得到的感染黑脛病的煙株根部組織（G）、莖基木質部組織（J）與4條引物在擴增試劑盒中在本反應體系之下可以發生反應，產生綠色熒光。感病烤煙組織經過直接反應產生的熒光較陽性對照菌株DNA經過LAMP反應產生的熒光略淺，但是仍然可用肉眼觀察到。陰性對照無菌水在相同條件下的反應沒有產生熒光。

3 結論與討論

本研究針對煙草疫霉菌的致病因子半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45設計了4條特異性引物，并利用Loopamp?朗報?脫氧核糖酸擴增試劑盒和熒光目視檢測試劑，在PCR儀中進行60℃條件下的LAMP反應60 min后，貴陽市開陽縣宅吉鄉和畢節市大方縣六龍鎮收集的煙草疫霉菌菌株的DNA均可以在本研究設計的檢測體系下發生反應，產生肉眼可以直接觀察到的綠色熒光反應，檢測方法快速高效。除此之外，利用這4條特異性引物和相應試劑盒中的各個試劑，將感染黑脛病煙株的根部組織和莖基部木質部組織在電熱恒溫水浴鍋中進行60℃條件下的LAMP反應60 min后，也可以發生反應，產生綠色熒光。直接從感染黑脛病組織上產生的熒光也能被肉眼直接觀察判斷。由此得出，青枯病[5]和柑橘線蟲病[6]等土傳性病害的LAMP檢測方法也可以在黑脛病上應用，本研究設計的LAMP檢測方法可以應用于黑脛病的檢測，結果快速準確。

吳 娜等[8]開發過一套針對煙草疫霉菌的分子標記位點核糖體轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）的LAMP檢測體系，靈敏度非常高。本研究開發的LAMP體系使用半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45為靶斑，靈敏度也足夠用肉眼分辨。但是，疫霉菌屬（Phytophthora）還有其他種類的幾種病原菌，能引起多種根腐類病害[9]，它們在ITS存在一定程度的相似性。本檢測體系針對的半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45是煙草疫霉菌特異性的致病因子[7]，對于煙草黑脛病的病原有極強的針對性，可以提高檢測的靈敏度。此外，本研究開發的LAMP體系利用普通電熱恒溫水浴鍋就可以完成檢測，直接針對感染黑脛病的煙株組織就能夠完成反應，方便煙葉站等分子實驗設備不充分的基層檢測隊伍使用，對于煙草黑脛病等土傳性病害的快速精確檢測有極大的促進作用。