小反芻獸疫病毒在Vero細胞中生長特性

文│次仁拉姆（西藏自治區獸醫生物藥品制造廠）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPRV）也稱作小反芻獸假性牛瘟、口炎腸肺炎綜合征等，是由小反芻獸疫病毒引起的烈性傳染病。調查發現，該病主要感染對象為小反芻獸，以山羊最為常見。現階段，并未發現感染人的病例。小反芻獸疫病毒和犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、牛麻疹病毒、海豹瘟病毒等相類似，它們均屬于副粘病毒科麻疹病毒屬成員。該病最早發生于1942年，在非洲西部的象牙海岸首次暴發，隨后被命名稱作小反芻疫病。小反芻獸疫幾乎在全球范圍內均有暴發，主要集中在亞洲和非洲的40多個國家。該病對畜牧業造成了嚴重影響，尤其是山羊和綿羊等養殖產業。在感染后，小反芻獸疫病毒通常對小反芻獸的上呼吸道淋巴樣組織、胃腸道有顯著的親和力，進而出現病理性變化。此外，該病毒主要通過氣溶膠進行傳播，從上呼吸道上皮組織入侵機體以后，迅速擴散到全身部位，機體的排泄分泌物為主要的感染源。通常情況下，已被感染的動物可通過分泌物與排泄物進行排毒，近距離的接觸會感染其他動物。在感染后的兩天時間內，可以通過檢測動物分泌物來進行判斷。

調查研究發現，在干燥、低溫及存在風沙的情況下，更容易出現細菌與小反芻獸疫的混合感染，并且在動物感染以后，其胚胎和精液中就會出現病毒，該種病毒也會通過受精作用或者胚胎移植進行傳播。因此，通常被感染的動物在其潛伏期為主要的感染源。小反芻獸疫會對小反芻獸健康帶來嚴重危害，已被列入一類動物疫病。針對小反芻疫病必須嚴加防范，及時采用有效措施進行預防。基于此，本研究通過對小反芻獸疫病毒在Vero細胞上的致細胞病變反應予以分析，完成對接種毒液的小反芻獸疫病毒數據的測定，給疫苗生產奠定基礎。

一、材料與方法

1.設備儀器。二氧化碳培養箱:德國Hearcell生產；倒置顯微鏡：上海光密儀器有限公司；生物安全柜：上海力申科學儀器公司；細胞觀測臺；細胞轉瓶機

2. 毒株選擇。原始毒株為clone9株，該毒株由中國獸醫藥品監察所提供。

3.細胞選擇。在小反芻獸疫病毒培養應用到的細胞為Vero傳代細胞，屬于非洲綠猴的腎細胞。（注：來源于生物藥品制造廠所保存的Vero細胞。）

4.細胞的復蘇。

（1）在進行細胞復蘇操作前半小時打開無菌室的A級潔凈度，對操作場所用苯酚5%消毒滅菌，并且用75%的酒精擦拭操作桌面。

（2）將凍存管迅速由液氮轉入到37℃水浴中（以防止-5℃二甲基亞砜對細胞的損傷）凍存管的頂部保持在水面上，以避免任何的污染，還要不定時地攪拌加速解凍。

（3）當細胞完全解凍后，用75%酒精擦拭凍存管，用離心機離心后，倒掉上清液，用營養液吹打使細胞完全分散，將細胞轉移到25平方厘米的克氏方瓶中，并加5%～8%的新生牛血清后在37℃溫室里培養。

5. 細胞傳代與接毒的操作步驟。

（1）在進行細胞系傳代操作前對實驗場所進行消毒滅菌20分鐘，并點燃酒精燈，用75%酒精棉將手擦拭一遍。

（2）將EDTA-胰酶溶液放在37℃的恒溫水浴箱中預熱。

（3）將待傳代的細胞培養瓶用75%酒精擦拭一遍后放在操作臺上。

（4）將細胞瓶中原有的細胞生長液倒入廢液缸中，在火焰的保護下用吸管向內加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS），以洗去細胞上存留的血清和營養液，然后倒掉PBS液。

（5）向細胞瓶加入適量的消化液即EDTA-胰酶溶液，輕輕搖動細胞瓶，使細胞與消化液充分接觸，提高消化效率，然后水平放置在桌面上。

（6）當細胞表面出現肉眼可見的毛玻璃樣，或出現針尖大小的縫隙時即可倒掉細胞消化液，平放在臺案上。

（7）待細胞面出現較大的裂痕時，細胞脫離瓶壁，此時細胞在胰酶的作用下仍繼續消化。

（8）用吸管向已消化好的細胞瓶中加入細胞生長液（營養液）將細胞沖下并輕輕吹打以充分分散細胞，此時細胞停止消化。

（9）根據細胞密度，確定適宜分散率，根據分散率補足細胞生長液，將細胞生長液充分混勻，在酒精燈火焰保護下，均勻的分裝在細胞瓶中。

（10）將細胞瓶上注明傳代細胞的系名稱、日期等信息，在37℃的溫室中培養。 將溫度控制在37℃，在溫室培養48小時～72小時后，選擇生長較好的Vero細胞單層，進行接毒，對小反芻獸疫病毒毒種按照細胞生長液的2%進行接種，將其放置在37℃溫室進行轉瓶培養，培養96小時～120小時，觀察小反芻獸疫病毒致細胞病變的情況、并按照病變情況進行收毒。

6. 獲取病毒生長相關數據。小反芻獸疫病毒的種毒clone9株，在經過接種以后得到長滿Vero細胞單層的瓶體，分別培養不同時間獲得相對應的病毒（此次研究可按照24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、144小時、168小時進行統計）。每瓶細胞應在規定觀察時間內，按下述標記錄病變程度。-:細胞正常。+：病變細胞約占25%。++：病變細胞約占50%。+++：病變細胞約占75%。#：病變細胞約占75%以上，或有脫落細胞。操作中需設置重復和陰性對照，經過凍融3次處理以后，應用病毒含量（TCID50）方法準確測定毒價。

二、結果

1.觀察Vero細胞的病變過程。按照此次實驗階段用于培養小反芻獸疫病毒使用的Vero傳代細胞，在不同時間點獲得Vero細胞的病變過程，詳細情況見圖1。

◎圖1 生物藥品制造廠所保存的Vero細胞病變過程示意圖

2. 細胞接毒后病毒含量測定檢驗，按照以下操作過程。

（1）在離心管中將病毒液10倍倍比稀釋處理，整個范圍控制在10-1～10-6。

（2）把稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每個稀釋度5個重復，各個孔接種量保持在100微升。

（3）在各個孔中加入對應的細胞懸液，使細胞量控制在20萬～30萬/毫升。

（4）以正常細胞作為對照，培養144小時，期間每天觀察病變的變化情況，并對結果進行統計。

具體操作示意見圖2。

◎圖2 操作示意

三、結果分析

1.細胞病變過程。在對小反芻獸疫病毒進行分離與培養期間，必須要有細胞培養物作為支持，此次研究過程采用Vero細胞。小反芻獸疫病毒感染后可以誘導宿主細胞使其成為合胞體，合胞體的核主要按照環狀進行排列，擁有類似于表盤狀的外觀結構。尤其是在羊的原代細胞培養物中，小反芻獸疫病毒展現出來的誘導過程更為顯著，特征結構較明顯，總體上病變細胞呈圓形拉絲狀并具有折射力。

結合Vero細胞的細胞病變特征，發現在細胞病變初期，細胞間隙會變大，有少量的細胞堆積到一起形成團狀結構，并且多個細胞在相互融合的條件下能夠呈現為多核狀態。而在細胞的中央部位存在團狀的細胞質，在其周圍擁有散射狀的折光環。同時，總體上細胞在64個小時左右就出現了合胞體，并且在細胞融合以后，其速度在加快、細胞融合的數量也在增多，最終變化為蜂窩狀的結構。在此階段病變特征極其明顯，緊接著合胞體會逐漸連接成片狀，合胞體變大，附近出現較明亮的光環。細胞達到144個小時后，開始出現脫落的跡象，在此條件可把細胞進行回收處理。

2.病毒生長過程分析。觀察小反芻獸疫病毒的生長情況，總體上在24個小時就進入到增殖階段，并且在48到96小時期間增殖速度較快，后期增殖速度開始減緩，且在120個小時病毒含量接近較高水平，這也反映出小反芻獸疫病毒在Vero細胞中的增殖情況。

3.TCID50檢驗結果。采用karber法進行統計計算，按照lgTCID50＝L－d（s－0.5），其中L為最高稀釋度的對數，d為稀釋度對數之間的差值，s為陽性孔比率總和。最終檢測出將該病毒稀釋10-3.875接種100微升時可使50%的細胞發生病變。