黃芪多糖對呼吸道合胞病毒所致幼鼠肺部感染的抗病毒作用及其機制

吳振波，邵淑蓉，陳虹宇

1麗水市中心醫院藥學部，浙江麗水 323000；2寧波市婦女兒童醫院藥劑科，浙江寧波 315012

人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是導致嬰幼兒急性和嚴重下呼吸道疾病的最常見病毒之一[1]，在發展中國家的死亡率較高[2-3]，且目前的治療方案仍局限于支持治療[4]。利巴韋林是唯一被批準用于治療RSV感染所致呼吸道疾病的抗病毒藥物，然而其療效和不良反應限制了其在免疫功能低下患兒中的應用[5]。因此，臨床迫切需要能有效治療RSV的藥物。既往研究證實植物提取物和草藥化合物具有抗病毒和免疫調節作用[6-7]。黃芪長期被作為許多中藥方劑的重要組成部分[8-9]，具有止汗、降壓、利尿和增補等作用[10]。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是從黃芪中提取的一種有效成分，研究證實其可調節免疫細胞功能和細胞因子的表達[11]，增強抗炎活性[12-13]及減少氣道重塑[14-15]，從而在哮喘治療中發揮重要作用。在抗病毒方面，有研究發現APS能夠減輕由單純皰疹病毒引起的星形膠質細胞損傷[16]。然而，目前尚無APS治療RSV肺部感染的相關研究。本研究探討了APS對RSV所致小鼠感染性肺炎的治療作用及其可能機制，旨在為尋找治療RSV所致呼吸道疾病的有效藥物提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 APS和利巴韋林購自美國Sigma-Aldrich公司，人喉癌上皮細胞(HEp-2，ATCCCCL-23)和RSV Long株(ATCC-VR-26)購自美國ATCC，胎牛血清、DMEM培養基及100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-18及IL-33酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒均購自中國Elabscience公司，10%多聚甲醛、1%結晶紫水溶液、RIPA強裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、封閉液、一抗及二抗稀釋液、ECL發光液均購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Merck-Millipore公司，抗小鼠CD3單克隆抗體(APC標記)、抗小鼠CD4單克隆抗體(FITC標記)、抗小鼠CD8單克隆抗體(PE標記)、小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、磷酸化的分裂素原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogenactivated protein kinases，p-MAPK)、MAPK、磷酸化的核轉錄因子κB(phosphorylated nuclear factor κB，p-NF-κB)、NF-κB及β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 RSV感染模型的建立及實驗分組 60只雄性3周齡BALB/c小鼠(SPF級，12～14 g)購自常州卡文斯實驗動物有限公司。將小鼠置于濕度為55%、溫度為20～25 ℃、12 h光/暗循環的標準條件下飼養，自由飲水、進食。將小鼠按照隨機數字表法分為6組(n=10)：對照組、RSV組、利巴韋林組、APS低劑量組、APS中劑量組及APS高劑量組。具體操作步驟為：將小鼠用乙醚輕度麻醉后，對照組滴鼻50 μl生理鹽水，其余各組小鼠均通過鼻腔滴注50 μl RSV-long株病毒溶液[含6.8×106個斑塊形成單位(pfu)]制備模型。滴鼻2 h后開始灌胃，APS低、中、高劑量組分別給予100、200、300 mg/(kg.d)APS灌胃[17]，利巴韋林組給予46 mg/(kg.d)利巴韋林灌胃，對照組及RSV模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，持續5 d。待氣道高反應性實驗檢測結束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，留取肺組織，摘眼球取血，肝素管抗凝，4 ℃、5000×g離心20 min獲得血清，儲存于–80 ℃冰箱中待用。

1.3 測量小鼠體重及計算肺指數 各組小鼠于RSV感染前3 d及感染后5 d連續稱重，然后取小鼠肺組織并稱重。肺指數計算公式為：肺指數=肺重量/體重。

1.4 空斑減數實驗檢測病毒滴度 制備肺組織勻漿，600×g離心5 min，取上清液加至培養有HEp-2細胞的24孔板中。培養2 h后棄去培養基，用PBS洗滌細胞2次，加入瓊脂糖覆蓋培養基。待瓊脂糖凝固后，將維持培養基添加至孔中，進一步培養5 d以形成菌斑。然后對細胞進行固定染色，計數斑塊數。

1.5 ELISA法檢測血清中炎性因子表達水平 使用ELISA試劑盒檢測RSV感染小鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的水平。具體操作按照試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，計算細胞因子水平。

1.6 肺組織抗氧化及氧化產物含量檢測 制備肺組織勻漿，根據試劑盒說明書采用比色法分別測定抗氧化產物GSH、SOD及氧化指標MDA的水平。

1.7 流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群水平 取100 μl外周血加入相應CD3、CD4和CD8抗體各5 μl，渦旋混勻后室溫、避光孵育30 min，然后加入1 ml稀釋溶血素，渦旋混勻樣品，室溫靜置15 min，400×g離心5 min后棄上清，加入2 ml PBS混勻，400×g離心5 min后棄上清，最后加入450 μl PBS重懸樣品，并采用流式細胞儀進行檢測。

1.8 Western blotting檢測肺組織蛋白表達水平 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA強裂解液處理肺組織，將溶解后的樣品在13 000×g、4 ℃條件下離心30 min留取上清液，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，用封閉液室溫封閉2 h，然后與一抗TLR4、p-MAPK、MAPK、p-NF-κB、NF-κB及β-actin抗體在4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，洗膜后以相應二抗室溫孵育PVDF膜1 h，使用ECL發光液進行目標蛋白可視化顯影，并采用Photoshop進行蛋白條帶灰度分析。

1.9 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步比較采用Dunnett'st檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 APS對RSV感染小鼠肺組織病毒載量的影響與對照組(0)比較，RSV組[(98.3±4.5)個]、APS低劑量組[(77.0±3.6)個]、APS中劑量組[(61.7±2.5)個]、APS高劑量組[(33.0±2.0)個]及利巴韋林組[(33.7±3.5)個]的空斑數量均明顯增加(P<0.05)；與RSV組比較，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組的空斑數量明顯減少(P<0.05)，且APS低、中、高劑量組的病毒載量呈劑量依賴性降低(P=0.0032)；利巴韋林組的空斑數量與APS高劑量比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 APS對RSV感染小鼠肺組織病毒載量的影響(n=10)Fig.1 Effect of APS on the viral load in lung tissue of RSV infected mice (n=10)

2.2 APS對RSV感染小鼠體重及肺指數的影響 與對照組比較，RSV組小鼠體重明顯降低(P<0.05)，而給予低、中、高劑量APS及利巴韋林治療后，小鼠體重明顯增加(P<0.05)，其中APS低、中、高劑量組小鼠體重呈劑量依賴性地增加(P<0.05)；此外，APS高劑量組小鼠較利巴韋林組體重增加更明顯(P<0.05)(圖2A)。與對照組(0.83%±0.09%)比較，RSV組感染小鼠的肺指數(1.63%±0.09%)明顯升高(P=0.0004)；而APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠肺指數(分別為1.44%±0.06%、1.34%±0.04%、1.16%±0.08%、1.24%±0.11%)均明顯低于RSV組(P=0.0424、0.0071、0.0027、0.0090)，其中，APS低、中、高劑量組的肺指數呈劑量依賴性地降低(P=0.0038)；此外，利巴韋林組的肺指數與APS高劑量組比較差異無統計學意義(P=0.3799)(圖2B)。

圖2 APS對RSV感染小鼠體重及肺指數的影響(n=10)Fig.2 Effects of APS on body weight and lung index of RSV infected mice (n=10)

2.3 APS對RSV感染小鼠血清中IL-1β、IL-18和IL-33水平的影響 ELISA檢測結果顯示，與對照組比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠血清中IL-1β、IL-18和IL-33水平均明顯升高(P<0.05)；與RSV組比較，APS低、中、高劑量組的IL-1β、IL-18和IL-33水平呈劑量依賴方式明顯降低(P<0.05)，利巴韋林組的IL-1β、IL-18和IL-33水平也明顯降低(P<0.05)；與APS高劑量組比較，利巴韋林組的IL-1β水平升高(P<0.05)，而IL-18和IL-33水平無明顯變化(P>0.05，圖3)。

圖3 APS對RSV感染小鼠血清IL-1β、IL-18和IL-33水平的影響(n=10)Fig.3 Effects of APS on the levels of IL-1β, IL-18 and IL-33 in serum of RSV infected mice (n=10)

2.4 APS對外周血CD4+、CD8+T細胞亞群水平的影響 流式細胞檢測結果顯示，與對照組比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠外周血中的CD4+T細胞百分比增高(P<0.05)，CD8+T細胞百分比降低(P<0.05)，CD4+/CD8+比值明顯增高(P<0.05)；與RSV組比較，低、中、高劑量APS及利巴韋林可明顯逆轉上述變化(P<0.05)，其中，低、中、高劑量APS呈劑量依賴方式發揮作用(P<0.05)。此外，利巴韋林組的CD4+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯高于APS高劑量組，而CD8+T細胞百分比明顯低于APS高劑量組(P<0.05)(圖4、表1)。

表1 各組小鼠外周血T細胞亞群水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of T cell subset levels among each group of mice (±s, n=10)

表1 各組小鼠外周血T細胞亞群水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of T cell subset levels among each group of mice (±s, n=10)

與對照組比較，(1)P<0.05；與RSV組比較，(2)P<0.05；與APS低劑量組比較，(3)P<0.05；與APS中劑量組比較，(4)P<0.05；與APS高劑量組比較，(5)P<0.05

組別 CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+對照組 23.55±1.07 8.70±0.66 2.72±0.26 RSV組 31.82±1.21(1) 6.20±0.70(1) 5.18±0.62(1)APS低劑量組 30.48±1.59(1)(2) 7.03±0.40(1)(2) 4.35±0.46(1)(2)APS中劑量組 26.20±2.72(1)(2)(3) 7.77±1.03(1)(2)(3) 3.44±0.74(1)(2)(3)APS高劑量組 24.53±1.70(1)(2)(3)(4) 8.10±0.40(1)(2)(3)(4) 3.04±0.30(1)(2)(3)(4)利巴韋林組 26.55±1.09(1)(2)(3)(5) 7.20±0.46(1)(2)(3)(4)(5) 3.70±0.27(1)(2)(3)(4)(5)F 9.979 4.578 8.981 P 0.0044 0.0379 0.0061

圖4 APS對外周血CD4+、CD8+ T細胞亞群的影響(n=10)Fig.4 Effects of APS on CD4+ and CD8+ T cell subsets in peripheral blood of RSV infected mice (n=10)

2.5 APS對肺組織MDA、SOD、GSH含量的影響與對照組比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠肺組織中抗氧化產物SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05)，而氧化產物MDA含量明顯升高(P<0.05)；APS低、中、高劑量組的SOD、GSH水平以劑量依賴方式明顯升高(P<0.05)，而MDA水平則呈現出相反的變化趨勢(P<0.05)；與RSV組比較，利巴韋林組的SOD、GSH水平明顯升高(P<0.05)，而MDA水平降低(P<0.05)。此外，利巴韋林組的SOD活性與APS高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但GSH水平明顯低于APS高劑量組，MDA水平明顯高于APS高劑量組(P<0.05)(圖5)。

圖5 APS對肺組織SOD、GSH和MDA含量的影響(n=10)Fig.5 Effects of APS on the contents of SOD, GSH and MDA in lung tissue (n=10)

2.6 APS對TLR4/MAPK/NF-κB信號通路的調節作用 Western blotting檢測結果顯示，與對照組

比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組TLR4、p-MAPK、p-NF-κB蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與RSV組比較，APS中、高劑量組及利巴韋林組的TLR4、p-MAPK、p-NF-κB蛋白水平明顯降低(P<0.05)。此外，利巴韋林組的TLR4、p-MAPK及p-NF-κB表達水平明顯高于APS高劑量組(P<0.05)(圖6)。

圖6 APS對TLR4/MAPK/NF-κB信號通路的調節作用(n=10)Fig.6 Regulating effects of APS on TLR4/MAPK/NF-κB signaling pathway (n=10)

3 討 論

RSV是下呼吸道感染的重要原因，可導致毛細支氣管炎和肺炎[18]。目前臨床上仍無有效、安全的RSV治療藥物。既往研究報道，利巴韋林具有抑制RSV復制的作用[19]，但近年的數據表明，利巴韋林對RSV感染引起的炎癥反應作用有限[18]，與本研究結果一致。因此，尋找可抑制RSV感染引起的炎癥反應的藥物具有重要意義。

APS具有抗氧化、抗炎、抗病毒及免疫調節等多種生物活性[20]。本研究發現，APS可抑制RSV誘導的小鼠體重減輕，并可降低肺指數，提示其可有效減輕RSV感染引起的肺水腫，改善小鼠的身體狀況。本研究還檢測了小鼠血清中的促炎細胞因子水平，發現高劑量APS可抑制RSV感染誘導的炎癥相關因子IL-1β、IL-18及IL-33的分泌，從而發揮抗炎作用。此外，空斑減數實驗發現，APS有降低RSV滴度、抑制病毒復制的作用。有研究發現，RSV肺炎小鼠體內的MDA水平升高，GSH和SOD活性降低[21]。已知MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的氧化終產物，具有細胞毒性[22]；細胞內GSH水平降低可使細胞對有害刺激的敏感性升高[23]；SOD活性降低可導致機體超氧化物的過量利用，進而產生自由基類物質損傷細胞[22]。本研究在小鼠RSV肺炎中發現，高劑量APS治療可逆轉MDA、GSH及SOD水平的變化，提示APS具有抗氧化作用。

本研究還探討了APS的免疫調節作用。已知在正常情況下，人體內輔助性T淋巴細胞(CD3+CD4+T細胞，簡稱CD4+T細胞)和細胞毒性T淋巴細胞(CD3+CD8+T細胞，簡稱CD8+T細胞)的比值相對穩定。本研究發現，當小鼠感染RSV后，CD4+、CD8+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值發生變化，提示RSV感染可誘導機體免疫平衡紊亂；而高劑量APS可調節CD4+/CD8+比值趨于正常，另外APS治療還可增高CD8+T細胞百分比，降低CD4+T細胞百分比，提示APS具有激活免疫反應及調節免疫失衡的雙向作用，從而發揮調節炎癥反應的作用。

此外，本研究還進一步探討了APS發揮抗炎、調節免疫作用的潛在機制。已知Toll樣受體(TLRs)是一類進化保守的模式識別受體，在機體識別病毒感染方面，具有調節干擾素和促炎性細胞因子產生等作用。Marchant等[24]發現，TLR4明顯集中于病毒與細胞的相互作用部位，可參與RSV病毒的內化。Marzec等[25]發現，TLR4參與了RSV所致小鼠肺部疾病的發生發展，可激活細胞免疫，促進炎癥復合物的產生。MAPK和NF-κB信號通路的激活在TLR4信號軸中起著至關重要的作用，最終可導致炎性細胞因子的釋放[26]。本研究發現，RSV可促進TLR4蛋白表達增多，并促使MAPK和NF-κB蛋白發生磷酸化，而APS可呈劑量依賴性地逆轉上述蛋白變化，從而抑制TLR/MAPK/NF-κB信號通路的激活，提示APS可能通過該通路抑制RSV感染引起的炎癥反應和氧化反應。鑒于動物實驗的局限性，雖然本研究發現高劑量APS可明顯抑制RSV誘導幼鼠肺炎的發生發展，但其對人體的有效治療濃度仍需進一步探索。

綜上所述，APS可抑制RSV病毒復制，調節免疫反應，減輕RSV引起的炎癥及氧化反應，且其機制可能與抑制TLR4/MAPK/NF-κB通路的激活有關。然而動物研究與人群研究相比存在其固有的局限性，因此，為明確APS對幼兒RSV肺炎的作用，今后仍需進行更為深入的人群研究，對APS應用于臨床的可能性加以探索。