環境微生物的資源挖掘、代謝機制及其群落代謝功能的研究進展

林筱嵐，楊姝悅，田 蘊

(廈門大學生命科學學院，濱海濕地生態系統教育部重點實驗室，福建 廈門 361102)

微生物多樣而靈活的代謝方式在其與無機世界和較高等生物之間的相互作用中不斷進化，在生態系統中發揮不可替代的作用，參與生物群落及其自然環境的自我調控.早期環境微生物研究主要依賴于純培養技術，在過去的30年中，依靠純培養技術所進行的研究獲得了一些有關自然生境中微生物的組成、物種多樣性及其代謝活性等信息.然而，環境微生物僅有不到1%是可培養的，大多數為未培養微生物[1].大量微生物的不可培養性成為經典微生物學研究自然環境中微生物遺傳多樣性及其代謝功能的一大障礙.微生物通常是以群落方式共生于自然環境中，它們的很多特性和代謝功能均基于整個群落環境及個體間的相互影響，微生物群落作為一個整體其作用是不可忽視的[2].由于傳統研究方法以及環境微生物本身(低豐度、未培養)等因素的限制，研究者們在試圖打開微生物群落這個“黑匣子”揭示并利用微生物群體生態功能的研究上顯得困難重重.

幸運的是，近年來分子生物學技術的發展，以及環境組學、微量分析技術、生物標記和同位素示蹤等技術的進步，為人們認識環境微生物提供了有利的支持，新的微生物譜系及其新穎的代謝方式不斷被發現和闡明.2005年第一株氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)純培養株——NitrosopumilusmaritimusSCM1被分離獲得，打破了自Winogradsky分離得到氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)以來對氮循環的中心環節且是限速步驟的硝化過程僅由AOB與NOB介導的固有認知，NitrosopumilusmaritimusSCM1至今仍是海洋AOA生理研究的模式菌株[3]；而厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,Anammox)菌的發現則改變了人們對傳統氮的生物地球化學循環的認識，即反硝化菌并不是唯一的產氮生物類群[4]，并改寫了全球氮循環模型；2006年，Raghoebarsing等[5]首次報道了厭氧甲烷氧化(anaerobic methane oxidation,AMO)偶聯反硝化(denitrifying-AMO，DAMO)的富集物，并首次發現了偶聯NO2-還原和AMO的NC10門細菌(CandidatusMethylomirabilisoxyfera)[6-7].DAMO是以甲烷作為電子供體，還原硝酸鹽或亞硝酸鹽而脫除氮素的新型生物反應.該反應的發現是對全球氮循環的一個補充，也是氮循環的一個新環節，偶聯了自然界的碳素和氮素循環，作為碳、氮循環的重要橋梁，在自然生態系統中起著巨大的作用，其發現對加深全球碳、氮循環的理解亦具有重要的意義.另外，由于甲烷是地球大氣中僅次于二氧化碳的第二號溫室氣體，它引起的溫室效應是同等質量二氧化碳的20～30倍，DAMO作用對于減少甲烷排放、降低溫室效應具有明顯的效果.因此，在自然生態系統中，DAMO作用必定是碳、氮循環都將重點關注的內容.而DAMO作用可以實現甲烷與NO3-/NO2-的同時去除，其在環境工程領域中也極具應用價值[8].第一株降解二噁英細菌Sphingomonassp.strain RW1的分離[9]，第一株苯并芘(benzo[a]pyrene,BaP)降解菌NovosphingobiumpentaromativoransUS6-1的獲得[10]，使得揭示微生物降解高生物毒性污染物的代謝途徑和調控機制，以及通過基因操作來調控代謝途徑、優化細胞功能、構建微生物細胞工廠進而高效去除有機污染物成為可能.自然界中的微生物可能還隱藏著許多未知的生理過程和功能，加上其極為龐大的生物量，其一舉一動都將深刻影響著全球的環境變化.因此，對自然生境中微生物尤其是對反映其生存與進化潛力的分子機制的探索具有重大意義.

本研究團隊致力于從生態學、生理學以及遺傳學層面揭示自然環境中重要的微生物過程.早期的研究主要聚焦于環境因子如何影響微生物代謝驅動的碳、氮循環及有機污染物降解過程；隨著分子生物學技術的發展，開始利用微生物靶向培養組、基因組、轉錄組、代謝組以及生物信息等技術，在物種水平、基因表達網絡以及群落代謝功能水平上鑒別和預測微生物種群、群落驅動碳、氮循環及典型有機污染物降解的生理功能，以期應用于水域富營養化的控制、溫室氣體的減排以及污染環境的生物修復等實踐中.

1 特殊代謝功能微生物資源的挖掘

微生物因其代謝多樣性和遺傳變異性使它們的酶體系能夠以最快的速度適應外界環境的變化，能在各種不同的自然環境中生長.同時，微生物具有資源豐富、生長快速且容易改造等獨特優勢，具有分解代謝污染物和生物合成目標化合物的巨大潛能，已經在農業、工業、食品、制藥、環境工程等領域有廣泛的應用[11].盡管自然環境中僅有不到1%的微生物是可培養的，其余大多數為未培養微生物，但是實驗室富集分離的傳統純培養方法對微生物生理生態功能的認識和利用做出了巨大貢獻，提供了重要的遺傳學分子資源.

本研究團隊致力于從有害藻華防治、石油烴降解及氮污染物轉化等方面開展特殊代謝功能微生物資源的挖掘工作，截至目前，已從近海、河口、濱海濕地以及大洋(印度洋)、極地等10余種生境的環境樣品中分離得到超過500株的可培養菌，涵蓋120個屬，其中以芽孢桿菌(Bacillus)為優勢菌屬，假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)、海桿菌(Marinobacter)和微桿菌(Microbacterium)緊隨其后(圖1).在這些菌株中，23株已經以新屬(10株)或新種(13株)發表[12-34]，涉及21個屬，如交替赤桿菌(Altererythrobacter)、Chitinimonas和Mangrovitalea等.這些菌株在環境中分布廣泛，從內陸至海洋涉及湖泊、近海、濕地及印度洋等生境，樣品來源囊括表層水體、深海海水、沉積物、藻際及實驗室條件的靶向富集培養體系等.從代謝功能上看，本研究團隊基于定向分離手段獲得了一批在污染物降解、環境凈化等領域展現出應用前景的菌株：具有殺/抑藻能力的C.prasina等，具有烷烴降解能力的Sphingosinithalassobacterportus和Litorivitapollutaquae，具有PAHs降解能力的Muricaudazhangzhouensis、Algoriphaguszhangzhouensis和Sphingomonaspolyaromaticivorans，以及代謝方式靈活多樣的兼性營養菌Nitrogeniibactermangrovi等.基于以上發現的微生物新種，本研究團隊進一步聯合多基因串聯的基因組系統進化分析，系統性地闡明了細菌界中最大的一個綱γ-變形菌綱中4個目的進化關系，并提出2個新目以及3個新科，將Cellvibrionales和 海洋螺菌目(Oceanospirillales)整合至假單胞桿菌目(Pseudomonadales)中，這是迄今為止對γ-變形菌綱系統進化關系最大規模的梳理和調整[35].

圖1 分離菌株的樣品來源、系統發育進化關系及代謝功(潛)能

1.1 殺/抑有害赤潮藻的功能微生物資源

隨著工業化進程速度加快，海洋富營養化引發的赤潮問題日益突出.本研究團隊針對有害藻華治理的問題，立足于“菌藻關系”，提出“以菌治藻”的策略，致力于殺藻菌株的分離篩選與殺藻機制的研究.目前已報道的殺藻微生物多通過分泌胞外殺藻物質的方式間接殺藻，國內外已對細菌間接殺藻開展了較多的研究，獲得了大量殺藻活性物質[36-39]，但這些活性物質在赤潮治理領域的應用中存在投入原位環境后殺藻生物有效性、生物安全性等問題.而與藻細胞直接接觸的藻際微生物往往對藻類的生長具有更加密切且直接的影響，但直接殺藻的機制不明、分子背景不清楚等問題大大限制了殺藻菌的實際應用.本研究團隊前期分離得到了一株具有殺藻活性的菌株C.prasinaLY03[21]，且殺藻譜檢測表明其對甲藻門的微小亞歷山大藻(Alexandriumminutum)、東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、錐狀斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)，黃藻門的赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)及綠藻門的亞心型扁藻(Tetraselmissubcordiformis)等均具有殺藻效果.值得注意的是，菌株LY03表現出了對藻細胞的趨化特性，并可能通過直接作用方式殺藻[40].進一步以假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)細胞為研究對象，通過生理生化檢測及基因組、轉錄組分析發現菌株LY03的直接接觸可使藻細胞的光合作用及抗氧化系統等嚴重受損，細胞內容物流失，最終導致藻細胞裂解死亡.

此外，本研究團隊從有害赤潮原因種塔瑪亞歷山大藻(A.tamarense)的藻際分離得到27株具有殺藻活性的菌株，涵蓋氣單胞菌(Alteromonas)、鹽單胞菌(Halomonas)、假交替單胞菌、弧菌(Vibrio)、科貝特氏菌(Cobetia)和海源菌(Idiomarina)6個屬，其中假交替單胞菌、弧菌和氣單胞菌為優勢菌屬.假交替單胞菌對塔瑪亞歷山大藻的殺藻活性在許多研究中都有報道，如Su等[41]和黃姿等[42]均分離得到隸屬于假交替單胞菌的菌株，發現它們能夠通過分泌具有殺藻活性的化合物特異性地抑制甚至殺死塔瑪亞歷山大藻；同時，Sun等[43]發現假交替單胞菌還對紅色赤潮藻(Akashiwosanguinea)具有殺藻活性，該菌能通過直接和間接兩種模式進行殺藻.在本研究團隊分離獲得的6株具備殺藻活性的弧菌菌株中，Vibriosp.BS02對許多有害藻種表現出不同程度的殺藻活性，并進一步獲得了Vibriosp.BS02分泌的殺藻活性物質，在有害藻華的控制和治理方面展現出應用潛能[44].

1.2 海洋兼性營養細菌新物種的發現

微生物的代謝模式遠比人們想象的復雜，其代謝途徑多樣，除了光合自養和有機異養之外，還有化能自養(chemoautotrophy)、化能異養(chemoheterotrophy)、光能異養(photoheterotrophy)和兼性營養(mixotrophy)等.其中，兼性營養微生物由于其代謝方式靈活多樣，在寡營養且多變的水域環境中占據著重要的生態位.目前，對海洋兼性營養微生物的研究主要集中于鞭毛蟲、微藻、螺旋藻(Spirulina)等真核生物，而對兼性營養細菌的研究卻屈指可數.藍細菌是較早被發現的具有兼性營養特性的細菌，一般認為這一類群在海洋環境中主要進行光合自養代謝[45]，而許多研究證實它們也具有利用有機物的能力[46].此外，研究者們還發現了少數無光合色素而依靠化能產能的兼性營養細菌，代表菌株包括具有反硝化能力的脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)[47]、可氧化硫代硫酸鹽的硫桿菌(Thiobacillus)[48]和Xanthobactertagetidis[49]，以及可氧化鐵離子的酸小桿菌(Acidimicrobium)[50]等.由于兼性營養菌具有代謝靈活性，它們面對環境變化表現出的適應性要比其他專性營養菌高得多.因此，在生存環境發生變化時，它們仍可以維持自身生長，甚至為其他微生物提供營養來源.然而，由于缺乏來源于不同生態環境的具有代表性的純培養模式菌株，人們對于這些兼性營養微生物的多樣性和生理功能的鑒別、代謝方式轉換的調控機制及生態相關性還知之甚少.因此，兼性營養微生物對生態系統中生物量的貢獻及其對生物地球化學循環的重要性可能一直被低估.

本研究團隊通過對紅樹林濕地沉積物進行BaP脅迫下的富集培養，分離得到大量可培養菌株.其中菌株M9-3-2的16SrRNA基因的最大序列相似度僅為93.6%，系統發育分析及生理生化特征檢測結果表明其為紅環菌目動膠菌科的新屬，命名為NitrogeniibactermangroviM9-3-2[30].進一步的全基因組分析及生理生化特征檢測發現，菌株M9-3-2與動膠菌科其他種屬的微生物相比分類地位新穎，生理代謝方式更為靈活多樣，兼具化能無機自養和化能有機異養特征：其具有完整的CO2自養固定途徑，可以NaHCO3為唯一碳源自養生長，同時還具有氰化物裂解酶、乙腈裂解酶以及硝基烷烴單加氧酶，可利用有機碳源異養生長；通過對注釋基因的進一步分析發現，菌株M9-3-2兼具固氮和反硝化代謝通路，并且通過實驗驗證該菌株為兼性厭氧菌，能夠應對多種生存環境，在極端環境下能夠通過聚集的方式維持自身生存，對BaP具有耐受性及潛在的降解能力，在好氧和厭氧的條件下都具有反硝化活性，顯示出其代謝方式靈活多變以應對不同的生存環境.海洋兼性營養細菌新物種的發現豐富了兼性營養微生物模式菌株資源，有利于兼性營養微生物的分布和生理功能的鑒別、代謝方式轉換的調控機制及其在自然生態系統和環境工程系統中生態功能等研究工作的開展.

1.3 石油烴降解菌的定向富集與分離

隨著經濟發展，石油已成為全球海洋環境中數量最大、危害嚴重的最主要的有機污染物.鑒于微生物修復在石油污染治理中的應用前景，本研究團隊基于石油污染富集體系對石油降解微生物進行定向馴化與分離，目前得到50余株具有石油降解能力的細菌，隸屬于食烷菌(Alcanivorax)、芽孢桿菌、Castellaniella、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、假單胞菌(Pseudomonas)、海旋菌(Thalassospira)、海桿菌、赤桿菌(Erythrobacter)及交替赤桿菌等22個屬，其中食烷菌、芽孢桿菌、交替赤桿菌和Castellaniella為優勢菌屬.食烷菌是專性石油降解菌，具有廣泛降解石油烷烴的代謝功能[31,51].本研究團隊分離得到的6株食烷菌與柴油食烷菌(A.dieselolei)、海洋食烷菌(A.marinus)、A.profundi等菌種的系統發育進化地位最相近，后經實驗證實，這6株菌均對柴油具有降解能力，能夠降解C14～C28的中長鏈烷烴.芽孢桿菌也是常見的石油降解菌[52]，本研究團隊分離獲得的4株芽孢桿菌菌株均能夠降解C14～C22的中等長度烷烴.隸屬于交替赤桿菌的4株菌和食烷菌展現出相當的降解能力，同樣能夠降解C14～C28的中長鏈烷烴.

無論是歷史遺留還是新生污染，PAHs的環境殘留一直是持續危害人類健康和生態安全的全球性問題.微生物介導的生物降解被認為是徹底去除PAHs污染最重要的途徑.本研究團隊采用改進的平板升華技術，分別從近海海域的表層海水、表層沉積物、河口海岸紅樹林濕地沉積物以及深海沉積物中篩選獲得多株高效的PAHs降解菌，隸屬于30個屬，其中芽孢桿菌、弧菌、Limnobacter和Labrenzia為優勢菌屬.芽孢桿菌因其強大的環境適應性廣布于各種生境中，經常從污染環境中分離得到，該類群中的許多菌株已被證實具有PAHs降解能力：如B.cereus在甲烷營養條件下可降解120 mg/L熒蒽，B.subtilis能夠通過不同代謝路徑降解高分子量PAH-BaP[52-53]；同時，許多芽孢桿菌還能夠產生、分泌表面活性劑，進一步促進疏水性強的PAHs的生物降解[54].這些代謝特征使得芽孢桿菌成為生物修復領域的熱門工具.此外，本研究團隊還分離獲得來自于鞘氨醇單胞菌、假單胞菌和新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium)等常見降解菌屬的菌株.這3個屬內包含許多芳烴降解者，具有很高的分解代謝多樣性，底物廣泛[55]，包括極難降解的高分子量PAHs[56-58].通過實驗驗證，從廈門博坦油碼頭分離得到的S.polyaromaticivorans能夠降解2～4環的PAHs[17].這些純培養降解微生物的地理分布、分類地位以及對PAHs的降解特性均不同，可以作為開發PAHs污染生物修復技術的菌源，更重要的是可以作為研究PAHs生物降解機制的模式菌株，為深入探究PAHs降解代謝通路、挖掘新穎的降解酶系、解析菌間關系，甚至構建高效降解高分子量PAHs的微生物群組提供寶貴的資源，為開發具有普遍意義及應用價值的生物修復技術奠定基礎.

2 降解功能微生物對高生物毒性PAHs脅迫的響應與降解機制

PAHs是一類由兩個或兩個以上的苯環以線形排列、彎接或簇聚的方式構成的有機物.隨著苯環數量的增加，其脂溶性越強而水溶性越低，且致癌、致畸、致突變效應也隨之增強.作為最早發現且數量最多的致癌物，目前已發現的致癌性PAHs及其衍生物已超過400種.作為持久性有機污染物，PAHs還具有生物蓄積性、長距離遷移性等特性，是全球普遍存在的污染物，嚴重威脅著人類健康和生存[52].微生物分解代謝是PAHs污染物自然消除的主要方式.微生物是自然界經過漫長的進化過程而最終選定的分解者，具有強大的降解能力，幾乎能降解世界上所有的有機物，包括人工合成的有機化合物，這使其在處理典型環境有機污染物方面具有巨大的潛力.然而，土著微生物的降解能力和底物作用范圍十分有限，通過基因工程優化降解菌，可以更有效地修復PAHs污染[55].PAHs污染在環境中以多種形式存在，在不同的環境中需要微生物具有降解不同類型污染物的能力.這不是簡單地改造一個或幾個基因就能夠解決的，需要對微生物進行系統全面的改造，并針對不同的環境設計和構建不同的工程菌.因此，從全局水平上尋找分解代謝功能基因資源及構建難降解化合物代謝菌株的代謝網絡是解決這些問題的關鍵.

目前，人們對PAHs的微生物降解機制更多的是關注代謝途徑的解析，而對于微生物如何與PAHs分子相互作用，通過何種方式介導PAHs進入細胞，以及如何響應PAHs污染的降解機制的研究較少，特別是對其分子基礎的研究十分欠缺.為此，本研究團隊以一株能降解2～5環PAHs的海洋細菌N.pentaromativoransUS6-1為模式菌株，以5環的PAH-BaP為研究對象，采用比較轉錄組學、關鍵基因敲除和回補、代謝產物分析、蛋白質與小分子相互作用以及蛋白質與蛋白質相互作用等研究手段，探究菌株US6-1感應、轉運和分解代謝PAHs的分子機制(圖2)，旨在為定向優化微生物功能，提高微生物轉化和降解高分子量PAHs(尤其是高生物毒性的BaP)的能力奠定分子基礎.

圖2 BaP脅迫下菌株US6-1的細胞代謝重構

2.1 外膜轉運蛋白TBDT參與菌株US6-1對PAHs的跨膜轉運[59]

底物的攝取與跨膜運輸是微生物分解代謝有機污染物的起始步驟，揭示微生物捕獲PAHs的分子轉運機制是實現有機物污染生物修復的重要前提.環境中的PAHs以多組分存在，并具有疏水性、難降解性和痕量性等特性，給生物降解技術的實際應用帶來很大困難.由于PAHs的熱穩定性與疏水性隨著苯環數的增加而逐漸增強，加上它們緊密吸附于顆粒物上，4環及4環以上的高分子量PAHs的生物降解難度大大高于低環PAHs.而PAHs的高度疏水性無疑成為微生物吸收和降解PAHs時需首先解決的問題.本研究團隊對菌株US6-1在PAHs脅迫下的轉錄組測序分析發現，在5環PAH-BaP脅迫下，有38個TBDT基因表達顯著上調.為探明TBDT是否參與菌株US6-1中BaP的攝取和轉運，本研究團隊構建了關鍵的TBDT基因缺失的突變株.結果發現，這些突變株的生長狀態與野生型菌株沒有明顯差異，但其對PAHs的降解能力下降，特別是缺失了編碼tbdt-11基因的突變株Δtbdt-11，幾乎喪失了對PAHs的降解能力.同時發現，在BaP脅迫下，Δtbdt-11的細胞表面疏水性明顯低于野生型菌株.此外，在Δtbdt-11中，編碼PAHs降解酶的基因轉錄活性顯著降低.通過共聚焦顯微鏡觀察發現，菌株US6-1可以通過外膜轉運BaP，但經質子動勢解偶聯劑處理后，野生型菌株US6-1的轉運能力顯著降低，進一步證實了tbdt-11基因與PAH主動運輸相關.這是目前獲得的首個關于外膜蛋白TBDT參與疏水性PAHs跨膜主動轉運的生物學實驗的證據，為實現疏水性PAHs跨膜轉運元件的設計與構建奠定了分子基礎.

2.2 MCPs在菌株US6-1趨化和降解BaP過程中的功能[60]

細菌的趨化性(chemotaxis)能夠增強細菌在自然界中降解污染物的效果，已知細菌對芳香化合物有趨化能力，但具體是如何感知化合物的并不清楚.細菌趨化性是指有運動能力的細菌對有利環境的趨附和對有害環境的避離運動，此行為是通過感應環境信號和調整鞭毛旋轉方向獲得的.微生物不能依賴傳質強化手段獲取烴，尤其是在常溫下保持固態的PAHs，因此這一運動性尤為重要.以前有關微生物對烴的攝取和烴降解菌的生長模型，很少考慮細菌趨化性的影響，這顯然是需要改進的.在本研究團隊的研究中：趨化性檢測結果顯示，菌株US6-1不僅對3環PAH菲(phenanthrene,Phe)、4環PAH芘(pyrene,Pyr)和5環PAH-BaP具有趨化性，對它們的代謝產物也具有趨化性；基因組分析發現，菌株US6-1中有4個MCPs含有配體結合域，可能與菌株US6-1趨化PAHs及其代謝產物相關；通過突變體構建、細菌雙雜交實驗、表面等離子共振等分析，首次發現菌株US6-1甲基趨化受體MCP03030和MCP18870能特異性地識別和結合PAHs及其代謝產物，觸發菌株US6-1對PAHs尤其是高分子量PAH-BaP的趨化，并通過趨化雙組分系統的下游信號通路在菌株US6-1轉運、適應與降解BaP過程中發揮重要作用.

2.3 菌株US6-1降解BaP的代謝路徑

微生物降解有機污染物的能力來源于微生物自身的基因組以及與之相對應的具有生物學功能的蛋白質等功能大分子，它們構成了微生物基本的代謝網絡，決定了利用微生物解決有機物污染的范圍和能力.近年來，對微生物降解PAHs技術應用領域的研究已經取得了初步的發展，但是對微生物分解代謝的理論研究總體上還十分欠缺，尚未發現足夠豐富的PAHs降解基因資源，尤其是4環以上的PAHs降解基因，對PAHs分解代謝的調控研究也不夠深入.由于PAHs由多個苯環以平面、角環或簇狀組合而成，微生物可多位點攻擊相應的苯環，這使得PAHs分解代謝具有復雜和多樣的PAHs降解酶系和調控機制.要解決這些問題，就必須從微生物分解代謝的分子基礎入手，解析微生物分解PAHs的代謝途徑，尋找具有特定催化降解能力的酶，表征各種降解酶系并闡明其催化機制.此外，微生物代謝途徑之間還存在相互聯系和作用，它們構成受環境因子調控和影響的復雜代謝網絡，因此，以微生物降解PAHs的調控為模式，明確基因型與代謝表型的關系，從分子水平上闡明細胞調控網絡和代謝網絡之間的關系，從而逐步解析細胞代謝有毒污染物的調控機制.本研究團隊首先通過比較轉錄組篩選出菌株US6-1中可能參與PAHs代謝的功能基因，然后利用基因敲除、蛋白表達等手段逐步驗證基因功能，再通過構建報告質粒、基因敲除、凝膠遷移率實驗等方法研究了PAHs降解和細胞響應BaP壓力的分子調控機制.同時，利用氣相色譜-質譜聯用檢測菌株US6-1降解BaP過程中的代謝產物，推測出菌株US6-1中PAHs的降解通路：BaP在C-7，8位開環時，下游產物可以通過Pyr和Phe的路徑進一步降解；Pyr會通過C-4，5位的開環，代謝進入Phe的降解路徑；Phe則可以在C-3，4位進行開環反應，進入已發現的降解路徑.這些結果為指導通過基因操作來調控代謝途徑及代謝功能進而高效地降解環境有機污染物提供了理論基礎.

3 微生物群落水平代謝功能的甄別與利用

微生物在生態系統中并不是獨自發揮功能的，通常是以群落方式共生于環境中，它們的很多特性和代謝功能均基于整個群落環境及個體間的相互影響.微生物群落水平的代謝功能是不同菌群之間合作、競爭、捕食等交互作用的結果，而這些菌間關系有些是生態水平上的(例如拮抗關系)，有些是代謝水平上的(例如偏利共生關系).但由于微生物之間相互作用關系的復雜性及其對環境因子變化的敏感性，在自然環境中直接找尋目標微生物與相應功能的關系十分困難，因此需要集成高通量分析和生物網絡技術，深入研究微生物群落的結構和相互關系[61].近幾年，微生物分子生態學和宏組學技術的蓬勃發展，以及計算機技術和數學模型的崛起，加速了人們對微生物群落水平功能和菌群相互作用的理解.

紅樹林濕地位于河口入海處，是阻止陸地污染向海洋生態系統擴散的一道堅固的大門，是海洋污染凈化工程的重要參與者，而紅樹林濕地微生物則是肩負這一重要使命不可替代的“特種兵”.紅樹林濕地微生物與系統內的其他因素共同作用，使得地處河口海岸潮間帶的紅樹林在減少濱海地區污染、凈化水域環境、減少污染物在水域生態系統食物網中的積累上有著重要作用.紅樹林濕地中豐富而又不失特色的微生物資源及其活躍而又多樣的生理活性，是研究微生物群落代謝功能的天然寶庫.為了探究紅樹林濕地微生物群落結構和功能特征，本研究團隊以福建省云霄縣紅樹林濕地為研究區域，通過理化參數分析、16SrRNA基因高通量測序及宏基因組分析，揭示該生境的環境理化特征、微生物群落的多樣性、結構及其功能特征[62].結果發現，漳江口紅樹林濕地呈現出富碳、多硫而氮限制的特征.基于16SrRNA基因及宏基因組的系統發育進化分析發現：綠彎菌門、硝化螺旋菌門以及變形菌門中的δ-和ε-變形菌綱在該生境中的優勢十分明顯，而這些類群的微生物大多與硫代謝有關，它們的優勢與生境多硫的特點相呼應，展現出具有環境適應性的微生物群組結構特征.在功能代謝層面上，宏基因組結果顯示，紅樹林微生物群落驅動的關鍵地球化學循環具有明顯的方向性：在氮代謝通路中，氨化、硝酸鹽異化還原路徑的優勢最為顯著；而在硫代謝中，硫酸鹽還原占絕對優勢.這些研究結果表明：微生物群組對紅樹林生態系統的高生產力及高效的元素循環具有重要的貢獻，對紅樹林生態系統的健康及多樣性具有指示作用；此外，微生物群落能夠在特定的環境條件下對結構和功能進行重新組裝，展現出強大的環境適應性和代謝靈活性.那么，在高毒性污染物輸入時，微生物群落是否也會重新組裝自身結構與功能以應對環境變化？這是否能夠為污染物生物修復提供有價值的信息？

自然環境中的微生物往往是以群落方式共生的，而PAHs的降解大多是通過不同菌株之間合作完成的，且PAHs環數越高，菌間合作也越明顯.與單菌相比，微生物群落能夠通過菌群的代謝交聯獲得單菌無法比擬的代謝可能性，例如有效地利用結構復雜的底物，或獲得更高的環境脅迫抵御能力等[2].因此，利用微生物群落去除污染物，已成為環境污染生物修復的有效手段之一.然而，自然環境中的微生物群落多樣性極高，菌群之間的相互作用關系錯綜復雜，并且原位修復的效率往往較低，可控性差，難以達到理想的去除效果.因此，相對自然菌群和單菌而言，基于對微生物群落結構與功能的理解，定向篩選功能微生物并進行組合，形成功能型微生物群組，是高效完成一些單一菌種或自然微生物群落難以完成的工作的有效手段.目前，微生物群組已應用于許多生物修復案例中.Mishra等[63]基于Aspergilluslentulus、A.terreus和Rhizopusoryzae3株菌構建了人工菌群，實現了金屬-染料復合型污染的修復；而Wanapaisan等[64]也通過人工菌群的構建實現了PAH-Pyr的高效降解.因此，從群落水平上探究微生物降解高分子量PAHs的代謝機制、解析菌群之間的合作關系，并以此為線索構建降解功能微生物群組，是突破高分子量PAHs降解瓶頸的有效手段.鑒于紅樹林生境蘊藏了豐富微生物資源的天然優勢，針對高環PAHs的降解難題，本研究團隊以5環PAH-BaP作為代表污染物，以紅樹林沉積物中的微生物群落作為研究對象，運用16SrRNA基因擴增子、鳥槍法宏基因組測序及生物信息分析等研究手段，從微生物群落的多樣性、結構演替、菌間關系、功能代謝等方面入手，解析微生物群落對BaP的響應和降解代謝過程，識別潛在的關鍵菌種.

關鍵物種(keystone taxa)是微生物群落的指揮者，驅動著微生物群組的結構與功能[65]，從菌間關系水平上識別BaP壓力下的關鍵物種，解析關鍵物種間關系的變化，是理解微生物群落響應和BaP降解過程的重要切入點.因此，在16SrRNA基因數據集基礎上，本研究團隊構建了時序性共現菌間關系網絡，對紅樹林微生物群落中不同菌群之間的相互關系及其動態變化進行解析.結果發現，在BaP壓力下，紅樹林微生物群落形成了復雜程度更高、更致密的合作共生模式，說明BaP污染刺激了更多菌間關系的產生.被刺激產生的合作共生主要發生在變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門這3個類群之間.根據拓撲角色鑒定，隸屬于擬桿菌門的Robiginitalea、變形菌門的新鞘氨醇桿菌和Marinicella被鑒別為關鍵物種.本研究團隊進一步基于鳥槍法宏基因組測序從功能水平上解析了紅樹林微生物群落對BaP污染的適應與降解代謝過程.結果發現，除PAHs降解通路外，過氧化物酶、硫醇化合物等氧化脅迫抵御機制[66]及生物膜形成[67-68]等抗逆相關功能基因也被顯著富集，這很可能是微生物群落抵抗BaP氧化脅迫的響應機制之一，說明幫助群落抵御BaP脅迫的輔助成員可能在BaP降解代謝過程中起著重要作用(圖3).這些結果為合理設計和構建高效降解BaP的微生物群組奠定了基礎.

圖3 紅樹林沉積物中微生物群落對BaP污染的響應與降解過程

4 自然生境中微生物群落代謝驅動元素循環功能的表征

生物地球化學循環主要由碳、氮、硫、磷和金屬元素等循環組成，在地球環境不斷改變的漫長歷史中，微生物在其中發揮著關鍵性作用[69].近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，研究者發現了很多新的微生物譜系.新的微生物代謝方式的闡明，使得關鍵生物地球化學循環理論不斷被修正和完善.如Anammox菌的發現，改變了人們對傳統氮的生物地球化學循環的認識，反硝化菌并不是唯一的產氮生物類群[70]；而好氧反硝化菌的發現更新了人們對反硝化過程在有氧條件下也可以進行的認識.最近Rabus等[71]報導了一株分離自海洋微氧區的新固氮菌，其在底物利用和能量獲取機制方面具有很高的多樣性和靈活性，預測其可能廣泛分布于較大的地理范圍內，對海洋氮的輸入有很大的貢獻.

濱海濕地紅樹林生態系統的生產力極高，這歸功于它所擁有的高效營養循環系統，其中微生物活動起著非常重要的作用，是驅動紅樹林生態系統中營養轉化的主要引擎，在元素循環過程中具有極其重要的意義.紅樹林濕地中豐富而又不失特色的微生物資源還隱藏著許多未知的生理過程和功能，加上其極為龐大的生物量，深刻影響著海洋乃至地球的環境.因此，揭示全球變化背景下，微生物在紅樹林沉積物碳流的形成、氮的轉化、硫的還原等過程中的作用及其與紅樹植物之間的營養關系機制，為進一步開發利用特殊環境功能的微生物資源，理解和表征紅樹林濕地元素循環的機制和規律的意義重大.本研究團隊通過野外長期觀測和控制實驗，采用傳統培養技術結合宏組學等現代方法系統研究了紅樹林濕地沉積物及根際微生物群落的多樣性和代謝特征，采用分子標記探針和穩定同位素示蹤技術，探討了人類活動影響下紅樹林濕地微生物群落如何通過碳、氮、硫等循環過程維持其自身及系統內生物多樣性的機制.如圖4所示，研究獲得了大量紅樹林生境特異性微生物種質和富集物資源.以紅樹林濕地沉積物中的微生物群落尤其是參與氮循環的功能微生物為研究對象，以16SrRNA基因和功能基因(氨單加氧酶基因amoA、肼氧化酶基因hzo、硝酸鹽還原酶基因narG和亞硝酸鹽還原酶基因nirS)為標記，采用功能基因文庫和定量PCR等技術手段，研究紅樹林濕地沉積物中參與氮循環功能的微生物的分布、豐度及功能，結果發現，紅樹林濕地沉積物中AOA對硝化作用的貢獻高于AOB，存在豐富的Anammox菌；來自氮轉化功能微生物DNA和RNA水平的數據顯示，紅樹林濕地沉積物中的硝化作用、Anammox作用和反硝化作用具有潛在的協同脫氮功能[72].采用穩定同位素示蹤技術、系統發育和功能基因分子標記等方法，首次在紅樹林沉積環境中發現了氮循環的新環節N-DAMO，沉積物中的NO2--AMO活性貢獻了紅樹林濕地系統中2%～6%甲烷的氧化，是以往濕地系統中被忽視的甲烷匯，也是潛在的鏈接碳、氮循環的橋梁[73].同樣采用穩定同位素示蹤技術、系統發育和功能基因分子標記等方法，對漳江口紅樹林濕地沉積物垂直剖面Anammox菌的多樣性、豐度和反應活性進行了評估，觀察到Anammox菌在紅樹林沉積物的不同深度廣泛分布，并在深層驅動大規模的Anammox反應，發現漳江口紅樹林沉積物中的Anammox過程能夠減少5.4%的外源氮負荷，是濕地系統中重要的無機氮匯[74].這些研究結果可為全球氮循環模型的升級提供具有區域特色的數據支撐.

圖4 紅樹林沉積物中微生物群落驅動的碳、氮、硫代謝路徑

5 總結與展望

隨著分子生物學、環境組學以及生物信息學工具和技術的發展，環境微生物學研究已進入一個嶄新的時代，研究者對微生物角色的認識已從傳統生態系統的生產者(producer)和分解者(degrader)拓展到關鍵生物地球化學循環的驅動者(driver)、鏈接者(linker)以及環境變化的指示者(indicator)和調控者(regulator)，并可能還有許多未知的角色功能有待發現.對微生物純培養資源的研究，有望在分子和細胞水平發現和闡明微生物代謝的新途徑和新機制，為優化微生物細胞功能提供分子元件和改造策略，實現環境污染物在模式生物中的智能降解以及目標化合物的綠色合成；同時也為在自然生態系統和工程系統(生物修復、工業處理、發酵工程等)中跟蹤、鑒別和優化微生物功能提供分子標記和強化方案.深入開展微生物群落水平代謝機制的研究，有望推動元素循環新環節的發現，揭示不同元素循環之間的偶聯機制，從時空維度上理解微生物之間、微生物與環境之間的相互作用模式，實現全球變化背景下生物地球化學循環的微生物表征以及生態系統功能的診斷和預測.而二者的有機結合有望為解決人類目前面臨的食品與醫藥短缺、環境污染、能源危機和水資源匱乏等重大問題，實現國民經濟的可持續發展戰略提供理論與技術支撐.