自主篩選的高效好氧反硝化細菌脫氮性能的研究*

李浩鈴,陳思睿，李杰彤，戚思蘭，陳寶龍，舒 琥

(1 廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006；2 華南師范大學附屬中學，廣東 廣州 510635)

在高密度集約化的養殖場中，2017年總氮排放量為216萬噸[1]，過量的飼料和排泄物導致氨氮等超標嚴重，污染養殖場周邊水體環境，養殖廢水的達標排放一直以來是養殖行業以及環保部門最為關注的話題。

生物脫氮，一般包括好氧硝化以及厭氧反硝化。異養硝化現象最早是由Papen H等在1894年從糞產堿桿菌Alcaligenesfaecalis中發現的[2]，研究者陸續在其他的方面也發現的異養硝化現象[3]；20世紀80年代，Robertson等首次分離鑒定出具有好氧反硝化作用的細菌——泛養硫球菌Thiospherapantotroph[4]，該菌株的發現很好地解決了厭氧和好氧嚴格分開的問題，傳統生物脫氮技術具有處理成本低、二次污染小等優勢[5-6]，但在某些極端環境中去除率并不高，且脫氮性能比較單一，無法滿足現今可持續發展的要求[7-8]。

本研究從養殖池中篩選出具有異樣硝化-好養反硝化作用的細菌，進行菌株脫氮性能的探究，為新型生物脫氮工藝提供一定的基礎資料和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源

廣東省廣州市西朗珠江水產研究所養殖池塘底泥。

1.1.2 主要試劑

革蘭氏染色試劑，鹽酸，氨基磺，亞硝酸鈉，氯化銨，硝酸鈉，磷酸，對氨基苯磺酰胺，N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽，氯化銨，酒石酸鉀鈉，納氏試劑等。

1.1.3 培養基

發酵培養基(g/L)：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，(NH4Cl 0.6036 g/NaNO30.9590 g/NaNO20.779 g)，檸檬酸鈉 5.66 g，微量元素溶液2 mL，H2O 1000 mL，pH 7.2；BTB培養基(g/L)：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，NaNO30.8415 g，NH4Cl 0.192 g，NaNO20.362 g，檸檬酸鈉 5.66 g，微量元素溶液 2 mL，BTB溶液1 mL，瓊脂25 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.2 方 法

1.2.1 菌株分離純化

稱取泥樣10 g用無菌水稀釋制備成10-1～10-5稀釋液，取0.1 mL在BTB培養基中進行涂布，倒置于28 ℃恒溫培養箱中培養1～3 d，再挑單菌落分區劃線3～4次，進行鏡檢以確定其純化與否。

1.2.1 菌株的篩選

將已純化的菌株利用點接法接種于BTB反硝化鑒定培養基中培養1～3 d，根據菌落與顏色圈之比篩選出反硝化性能較強的菌株。將菌株接種于營養肉湯中以28 ℃，180 r/min振蕩培養1 d，以1%的接種量分別接種于三種模擬廢水的培養基中，以28 ℃，180 r/min振蕩，每隔24 h取2mL發酵液，取滿48h，測OD600后，并以 4000 r/min，5 min 離心處理，分別測量三種氮源的含量，并將性能較好的菌株用營養瓊脂斜面培養基保存。

1.2.2 脫氮性能測定

將復篩所得的性能較強的菌株BB18斜面，重復1.2.1步驟，每隔12 h取2 mL發酵液，取滿48 h，測量OD600后離心處理，分別測量三種氮源的含量。

1.2.3 測定分析方法

菌群的生長情況采用酶標儀分析，氨氮采用納氏試劑分光光度法(GB HJ535-2009)測定；亞硝態氮采用N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法(GB 7493-87)測定；硝態氮采用紫外分光光度法(GBHJ/T346-200)測定；除氮率計算公式如下：

式中：C0為0 h的濃度，Ci為i h的濃度。

1.2.4 菌株的鑒定

對菌株的菌落形態進行檢測[9-10]和16SrRNA PCR擴增，采用一對通用引物[11]：上游引物(27F)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物(1492R)：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′，采用20 μL PCR反應體系：2×HieffTM PCR Master Mix(With Dye)1 μL，27F和1492R各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 預變性，1 min；55 ℃退火，1 min；72 ℃延伸 1.5 min；72 ℃，8 min；循 環 30 次。

通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 結果，將PCR 產物的純化和測序送至上海生物工程有限公司，測序結果通過 ExBioCloud比對分析，并利用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選、純化

通過分離純化，初步分離到82株具有脫氮性能的菌株，通過BTB反硝化鑒定培養基初篩得36株菌株，最后利用48 h內脫氮性能降解情況復篩得到5株能降解三種氮源的菌株。

2.2 BB18菌株脫氮性能的測定

在2.1菌株復篩的結果中，選擇一株脫氮性能最強且比較明顯的菌株BB18，在模擬養殖廢水的發酵液中進行脫氮性能測定。

2.2.1 BB18在模擬廢水中氨氮降解情況

圖1 BB18菌株在氨氮模擬廢水中的生長及氨氮降解情況

2.2.2 BB18在模擬廢水中亞硝態氮降解情況

圖2 BB18菌株在亞硝態氮模擬廢水中的生長及亞硝態氮降解情況

2.2.3 BB18在模擬廢水中硝態氮降解情況

在硝態氮模擬廢水中，測定菌株的生長量OD600和硝態氮含量OD275和OD220，結果如圖3 所示，菌株在經歷約6 h遲緩期后，逐漸上升進入對數期，在24 h 達到最大值；硝態氮降解率隨著對數期而升高，0～24 h降解率上升，24 h后略微地上升，在48 h 達到80.60%。前期由于菌體需要適應高濃度的硝酸鹽環境，因此一開始菌株生長比較慢，從而硝酸鹽利用率低。由圖3可知，菌株對硝酸鹽的利用是相對比較高的。

圖3 BB18菌株在硝態氮模擬廢水中的生長及硝態氮降解情況

2.3 BB18菌株的形態學

如圖4、圖5所示，菌株BB18菌落大小中等、米白色、圓形，邊緣不整齊，不透明，質地光滑，有粘性，表面略突起；顯微鏡下細胞直桿狀，單個排列，無芽孢革蘭氏陰性。

圖4 BB18菌株平板菌落形態特征

圖5 BB18菌株革蘭氏染色鏡檢

2.4 BB18菌株16S rRNA 的序列測定及系統進化樹

如圖6、圖7所示，BB18通過ExBioCloud比對后，具有高相似度的Pseudomonasguguanensis、P.medocina等通過MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹，在發育樹中，通過分支長度和自展值可得，菌株BB18為假單胞菌屬，與P.alcaligenes、P.fluvialis、P.guguanensis和P.pharmacofabricae進化方向相同，與P.guguanensis的親緣關系最為接近，且bootstrap值為100，可靠度最強。

圖6 菌株BB18 16S rRNA PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖7 BB18的系統發育樹

3 討 論

近年來，水產養殖業中養殖飼料殘餌和排泄物等物質的分解，導致水體中氨態氮等含量過高[12]，造成的經濟損失無法估量，目前大多數處理污水采用的是傳統脫氮技術與生物脫氮結合，但其消耗的成本比較高。

在進行脫氮性能的測定中，菌株BB18具有高效脫氮性能，氨氮、亞硝態氮、硝態氮去除率分別為92.76%、80.60%、90.95%，所得結果與成鈺等人在以葡萄糖作為碳源的反硝化培養基中分離的花津灘芽孢桿菌的情況相似[13]，其菌株24 h內對氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的去除率分別達到100%、99.5%和85.6%，相比劉小英等從污水池的活性淤泥篩選的氨氮降解周期為5d的菌株[14]，說明BB18具有高效脫氮性能和脫氮周期短的特點。

4 結 論

BB18菌落中等大小，為米白色，呈現圓形，邊緣不整齊，不透明，質地光滑，有粘性，表面略突起，細胞形態呈現直桿狀，單個排列，初步鑒定為假單胞菌屬，在28 ℃培養48 h，在12～18 h內到達生長對數期，其氨氮去除率在18 h可達92.76%，硝態氮去除率在48 h可達80.60%，亞硝態氮去除率在24 h可高達90.95%。