低共熔溶劑提取西蘭花總黃酮工藝研究

徐唐蕓，陳穎穎，魯東昊，陸 翔，陳凌濤，陳培云

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315000)

黃酮類化合物(flavonoids)在結(jié)構(gòu)上是兩個(gè)苯環(huán)通過三個(gè)碳原子相互連接而形成的具有C6-C3-C6基本碳架的化合物[1]。廣泛存在于絕大多數(shù)果蔬和藥用植物中。目前已被發(fā)現(xiàn)達(dá)到萬種[2]，是具多種生物活性的一類植物次生代謝產(chǎn)品。研究結(jié)果，表明黃酮類化合物具有多種生理作用，如抗氧化、抗自由基、預(yù)防炎癥、抑制細(xì)菌、抗腫瘤、降低血脂及膽固醇、提高機(jī)體免疫力、護(hù)肝作用和應(yīng)用于受創(chuàng)傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療等[3-7]。因此，如何從植物中有效提取出黃酮類化合物是久經(jīng)不衰的研究熱點(diǎn)。

十字花科蔬菜是黃酮類化合物含量較高的蔬菜種類[8]。西蘭花，別名花椰菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytis L.)為十字花科蕓薹屬的一或二年生草本植物，是甘藍(lán)的變種，因西蘭花的適應(yīng)性較強(qiáng)，目前在我國(guó)除西部地區(qū)之外都在大量種植西蘭花，如臨海的西蘭花種植基地規(guī)模及產(chǎn)量很高且為其農(nóng)業(yè)名片之一[9]。西蘭花富含多種功能性成分如蛋白質(zhì)、多糖、維生素和胡蘿卜素，還有豐富的黃酮類化合物[10]。為擴(kuò)大西蘭花的產(chǎn)業(yè)價(jià)值鏈，黃酮類化合物的提取是西蘭花產(chǎn)品深加工的出路之一。而大部分黃酮類化合物在西蘭花的花蕾富集[11]。

目前大多數(shù)黃酮類化合物提取工藝中使用的溶劑通常都不可再生，且還存在易燃、易揮發(fā)，大多還有毒性，普遍有污染環(huán)境的問題[12]。低共熔溶劑(Deep eutectic solvents，DESs)是Abbott提出的由一定比例的氫鍵受體(HBA)和氫鍵給體(HBD)組合成的兩或三組分低共熔混合物，具有無毒、可降解、輕易制備、成本低及具有離子液體的長(zhǎng)處等優(yōu)勢(shì)[13-14]。因此，越來越多的注意力集中在DESs的應(yīng)用上[15]。在應(yīng)用DESs提取黃酮方面，Xia等[16]建立了一種利用由氯化膽堿、乳酸合成DESs，從玉竹的根莖中提取黃酮類活性成分的方法。Naseem等[17]應(yīng)用由氯化膽堿和乙二醇組成的DES實(shí)現(xiàn)對(duì)檸檬香茅中包括黃酮類在內(nèi)的活性成的萃取且優(yōu)于常規(guī)溶劑。李婷婷[18]采用加熱方法制備低共熔溶劑，以 1:2 的氯化膽堿/乳酸含水量為 20%的低共熔溶劑作為提取溶劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素的高效提取。DESs作為萃取劑，為綠色高效萃取提供了新方法和新思路。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成低共熔溶劑用于西蘭花花蕾中總黃酮的提取研究，以西蘭花花蕾總黃酮的提取率為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化西蘭花花蕾總黃酮的提取工藝，以期望提供一種高效環(huán)保的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

西蘭花材料購自寧波本地超市。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

1.2.1 試劑

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化膽堿、丙三醇、乙二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品采購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2.2 儀器

L18-Y91A高速破壁調(diào)理機(jī)，九陽股份有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海蟻霖科學(xué)儀器有限公司；QL861漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；LC-180低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；UV-3000PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 制備DESs溶劑

DESs種類不同，對(duì)黃酮的提取效果不同[19-21]，以氯化膽堿(HBA)與不同的HBD按一定的摩爾比混合，采用加熱法[22]，即在80 ℃下攪拌，直至呈現(xiàn)無色均勻的液體，然后冷卻至室溫，制備出不同的DESs，如表1所示。

表1 不同的EDS溶劑種類及其比例

1.3.2 西蘭花花蕾總黃酮提取方法

取適量西蘭花花蕾，進(jìn)行剪切處理，放入干燥箱中進(jìn)行干燥，干燥溫度90 ℃，時(shí)間為2 h。冷卻后用磨粉機(jī)粉碎成粉末，先后過40、60目篩，備用。準(zhǔn)確稱取西蘭花花蕾粉末 0.5 g于裝入50 mL離心管中，加入一定液料比的不同含水量的DESs，用漩渦震蕩儀充分混勻后，在一定溫度下，水浴加熱一定時(shí)間，以5000 r/min離心15 min取得上清液，得到總黃酮提取液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取10 mg蘆丁標(biāo)品，用60%乙醇溶解，配制成 0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL比色管中，加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，震蕩均勻后靜置5 min，再加入10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇定容，震蕩均勻后靜置15 min。在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)蘆丁濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 西蘭花花蕾總黃酮含量測(cè)定

取樣品總黃酮提取液適量至25 mL比色管中，后續(xù)操作按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮濃度。按下列公式計(jì)算其提取率，公式[23]如下：

W(總黃酮得率，mg/g)=

1.3.5 單因素測(cè)定

采用單因素試驗(yàn)考察HBA-HBD摩爾比、DES含水量、液料比、水浴溫度、提取時(shí)間對(duì)西蘭花花蕾總黃酮提取效果的影響。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 單因素試驗(yàn)表

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取工藝條件液料比、溫度和提取時(shí)間進(jìn)行L9(33)，探討該三個(gè)因素及其不同水平對(duì)西蘭花花蕾中總黃酮得率的影響。正交試驗(yàn)因素水平如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度的測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，有顯著的呈線性。線性回歸方程為Y=13.715x-0.0026，R2=0.9999，其中Y為吸光度，X為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同的EDS溶劑種類提取結(jié)果

不同氫鍵供體的類型是影響DESs密度、表面張力和粘度等物理化學(xué)性質(zhì)的因素，也對(duì)目標(biāo)成分的提取有重要的影響[24]。以氯化膽堿為HBA，并選擇不一樣的HBD，加熱攪拌后制備DES。比較不同的HBD的DES對(duì)總黃酮得率的影響，制備四種不同的DES，結(jié)果如圖2所示，總黃酮得率的大小為1，4-丁二醇>1，2-丙二醇>乙二醇>丙三醇。其中1，4-丁二醇總黃酮得率達(dá)到3.224 mg/g。因此，最終確定1，4-丁二醇為最佳提取溶劑，作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。

圖2 不同DESs對(duì)西蘭花花蕾總黃酮得率的影響

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同HBA-HBD摩爾比的DES對(duì)總黃酮得率的影響

固定氯化膽堿(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)為DES，30%含水量，液料比1:25，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min，在DES摩爾比1:1、1:2、1:3、1:4的條件下，西蘭花花蕾最終的總黃酮得率如圖3示。隨HBA-HBD摩爾比的增大，得率也在提高，在HBA-HBD摩爾比為1:3時(shí)達(dá)到最大值，在更高的摩爾比時(shí)，得率反而下降。可能是因?yàn)槟柋葹?:3的DES具有更低的黏度和表面張力，提高了傳質(zhì)率，使提取溶劑更易去滲透和促進(jìn)溶出西蘭花花蕾的總黃酮。因此，確定氯化膽堿(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)摩爾比為1:3的DES為最佳比例的提取溶劑，作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。

圖3 HBA-HBD摩爾比的DES對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.2 不同含水量的DES對(duì)總黃酮得率的影響

固定氯化膽堿(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)摩爾比1:3的DES，液料比1:25，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min，在含水量為10%、20%、30%、40%、50%的條件下，西蘭花花蕾總黃酮提取率如圖4所示。隨著DES含水量的增多，總黃酮的得率不斷上升，當(dāng)DES含水量為30%時(shí)，總黃酮的率達(dá)到最高，超過30%后，總黃酮得率又開始下降。這可能是因?yàn)楹坑绊慏ES的極性和粘度，水的加入使DES的粘度降低和極性增加，但是過量的水反而會(huì)抑制成分間的相互作用，因此確定DES最佳含水量為30%作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。

圖4 不同含水量的DES對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.3 不同液料比對(duì)總黃酮得率的影響

固定氯化膽堿(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)摩爾比1:3的DES，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min，在液料比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的條件下，西蘭花花蕾的總黃酮得率如圖5示。隨液料比的增大，總黃酮的得率增大。但是液料比達(dá)到1:25以后不再增加，開始出現(xiàn)下降。這可能是因?yàn)橐毫媳葘?duì)總黃酮的傳質(zhì)率有重要影響，液料比的增加增大了西蘭花花蕾顆粒與DES之間的接觸面積和使樣品成分濃度的下降，增大了黃酮類化合物向溶劑移動(dòng)的擴(kuò)散系數(shù)，因此會(huì)增加非目標(biāo)物質(zhì)的析出，影響提取效果，還會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)，提高成本。因此，確定1:25為最佳液料比，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖5 液料比對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.4 不同提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響

固定氯化膽堿(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)，摩爾比1:3的DES，30%含水量，液料比1:25，提取時(shí)間60 min，在提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的條件下，西蘭花花蕾總黃酮得率如圖6所示。隨著提取溫度在一定范圍內(nèi)的不斷升高，西蘭花花蕾總黃酮的得率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度到達(dá)70 ℃時(shí)，得率到達(dá)最高，隨后得率隨提取溫度的升高反而降落。這可能是因?yàn)樯邷囟葧?huì)導(dǎo)致DES的粘度、表面張力和極性降低，有利于總黃酮的溶出。升高溫度會(huì)加快分子的活動(dòng)，加快目標(biāo)物質(zhì)擴(kuò)散。但過高的溫度將會(huì)導(dǎo)致黃酮類發(fā)生如氧化分解等現(xiàn)象，從而降低得率。因此，確定提取溫度為 70 ℃，作為后續(xù)最佳提取溫度。

圖6 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.5 不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

固定氯化膽堿(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)，摩爾比1:3的DES，30%含水量，液料比1:25，提取溫度70 ℃，在提取時(shí)間分別為40、50、60、70、80 min的條件下，西蘭花花蕾總黃酮提取率如圖7所示。隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，西蘭花花蕾總黃酮的得率升高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到70 min后，西蘭花花蕾總黃酮得率達(dá)到最大，且不再增加反而出現(xiàn)降低。這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，使DES充分滲透于西蘭花花蕾顆粒中，促使目標(biāo)物質(zhì)溶出，使總黃酮得率提高。而進(jìn)一步延長(zhǎng)萃取時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物的分解或者是發(fā)生其他的化學(xué)反應(yīng)。因此，確定60 min的提取時(shí)間，作為最佳提取時(shí)間。

圖7 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用正交L9(33)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以其得率為指標(biāo)，結(jié)果與分析見表3。由此可見，三因素對(duì)西蘭花花蕾總黃酮提取影響強(qiáng)度依次為：C>A>B，即提取時(shí)間>液料比>溫度。其中在提取時(shí)間中最佳水平為C3，液料比中最佳水平為A2，溫度中最佳水平為B3。因此，最佳組合為A2B3C3。由于該組合未在試驗(yàn)中出現(xiàn)，因此需驗(yàn)證并重復(fù)三次。結(jié)果表明，在該最佳組合條件中得到西蘭花花蕾總黃酮得率為(4.435±0.023)mg/g，高于組合A2B2C3的得率，說明試驗(yàn)可靠。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析

3 結(jié) 論

因大部分黃酮類化合物在西蘭花的花蕾富集，本文采用低共熔溶劑作為溶劑，以西蘭花花蕾總黃酮得率為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化西蘭花花蕾總黃酮的提取工藝。選用摩爾比為1:3的氯化膽堿和1，4-丁二醇制備低共熔溶劑，取得當(dāng)?shù)凸踩廴軇┖繛?0%，料液比1:25，溫度75 ℃提取 65 min時(shí)，總黃酮最后得率可達(dá)(4.435±0.023)mg/g的結(jié)果。該研究結(jié)果表明低共熔溶劑可作為提取西蘭花花蕾總黃酮的有效提取溶劑。