微藻-真菌共生體凈化沼液效果研究

詹新同

(欽覃(上海)環境工程有限公司，上海 200030)

沼液是沼氣制備過程中常見的副產物之一，是一種具有高污染物負荷的污水，如不經處理而直接排放會對周邊環境產生嚴重的危害[1-2]，因此沼液污染是限制沼氣事業可持續發展的一個重要因素。近年來，微藻應用于污水處理的研究得到了越來越多的關注。Golueke等[3]在1957年就首次提出了將沼液應用于培養微藻的相關研究。Collet等[4]認為沼液包含了微藻生長所須的營養元素，且碳氮比(C/N)和碳磷比(C/P)都較低，非常適合微藻的大規模增殖。隨后相關學者開展了利用微藻處理沼液的研究工作，如劉振強等開展了利用微綠球藻、小球藻和纖維藻在四種不同反應器(槽式反應器、直管式反應器、鼓泡式反應器和氣升式反應器)中凈化沼液的研究工作[5]；劉偉等[6]開展了利用豬場沼液養殖微藻連續系統的設計和應用研究。以上研究均表明微藻對沼液的生物凈化具有較好的處理效果。如研究發現沼液中氮、磷營養物去除率的高低與微藻的生長狀況呈正相關[7]。但深入研究發現利用單一微藻處理沼液仍存在一定的應用局限性，具體表現為微藻個體微小，后期的藻體回收、分離困難，因藻體的分離回收而造成廢水處理成本較高[8-9]。

本研究利用前期篩選出的具有高耐污性的優勢微藻(小球藻和斜生柵藻)及真菌菌種(靈芝菌)，研究確定了微藻和靈芝菌形成共生體的最佳形成條件；并對光生物反應器中優勢藻菌共生體凈化沼液的影響因素進行了探究，確定了最佳光照條件和光周期變化，實現了沼液污染物去除效果的最優化。研究結論能為藻菌共生體在沼液生物凈化中的技術應用提供理論基礎。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

實驗涉及的儀器包括：XZ-21KT型高速冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Unique-R20型多功能超純水機，廈門銳思捷水純化技術有限公司；FE28型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；UV-1800PC型紫外分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；HCA-102型標準COD消解器，泰州市國瑞分析儀器廠；HZ-9310KBG型臥式光照搖床，太倉市華利達實驗設備有限公司；GZP-250S型光照培養箱，上海精宏程控光照培養箱；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；QL-866型旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MS204TS型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GZX-9246MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZDDN-Ⅱ型自動型凱式定氮儀，浙江托普云農科技股份有限公司；Primo Star型正置顯微鏡，卡爾蔡司股份公司。

實驗所用材料和試劑包括：二甲基亞砜、葡萄糖、尿素、二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀、二水合氯化鈣、七水合硫酸鎂、重鉻酸鉀、鄰菲啰啉、硫酸亞鐵銨、濃硫酸、硫酸銀、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硝酸鉀、抗壞血酸、鉬酸銨、酒石酸銻鉀(半水)、硝酸鈉、丙酮、戊二醛、濃鹽酸、冰乙酸、無水乙醇、乙二胺四乙酸二鈉、苯酚、磷酸緩沖液、BG11培養基、PDA培養基。以上試劑均為分析純，均購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 藻種培養

小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)均購于中國科學院武漢水生生物研究所。選取標準BG11培養基，在光照培養箱中對藻種進行培養及擴培，培養及擴培條件：溫度為(25±0.5)℃，pH為6.95±0.18，光強度為200 μmol/m2·s，光周期為12 h晝/12 h夜[12]。實驗所用靈芝菌真菌菌種購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。菌株經PDA斜面培養基活化后，接入液體PDA培養基中，在28 ℃條件下搖床(160 rpm)培養3天，備用。

藻菌共生體的培養及擴培同樣在光照培養箱中進行，溫度為(25±0.5)℃，光照強度為200 μmol/(m2·s)，選擇在馴化BG11培養基(BG11培養基+2%麥芽糖+0.5%酵母膏)中進行。取預先擴培后的小球藻培養液20 mL經離心后去除上清液，離心沉淀利用馴化培養基洗滌2次，然后接種于100 mL馴化BG11液體培養基中(計數)，同時接種不同的真菌菌液(計數)。保持12 h晝/12 h夜的光周期，到對數生長期再擴大培養，然后保存于儲備液中備用。

1.3 沼液來源、預處理與理化特性

原沼液是來自江蘇“宏茂農場”其發酵裝置是利用豬糞和農業秸稈混合厭氧發酵產沼氣。厭氧發酵裝置所產沼液全部儲存于池中，取沼液時利用塑料桶和麻繩將沼液從沼液池中分多次取出，然后裝到塑料化工壺內帶回實驗室備用。

原沼液先過濾，以去除其中的沉積物及懸浮顆粒物，濾出沼液收集后再經過紫外線殺菌器處理5 min。經實驗室分析測定，備用沼液水質指標如下：pH 6.83±0.22，COD(1212.24±37.65)mg/L，TN(96.38±6.31)mg/L，TP(21.05±1.98)mg/L。

1.4 實驗設計

1.4.1 藻菌共生體的形成研究

在藻菌共生體的構建實驗過程中，藻細胞(小球藻或斜生柵藻)接種量為2.0×107cell/mL，培養量50 mL，160 rmp，培養溫度(25±0.5)℃，光照強度為200 μmol/m2·s，光周期設置12h晝/12h夜，藻-靈芝菌的比例(細胞數比例)設置為1:1、1:10、1:20、1:30，共培養7 d后借助顯微鏡考察不同藻菌配比條件下構建的藻菌共生體的大小與數量。隨后，在最優藻菌比例的條件下，分別在轉速100 rpm、160 rpm、220 rpm的條件下共培養7 d，考察共培轉速對構建藻菌共生體的影響。

1.4.2 藻菌共生體凈化沼液效果研究

實驗在自主設計的罐式光生物反應器(圖1)中進行，光照培養條件：溫度(25±0.5)℃，速度160 rpm，光強度為200 μmol/(m2·s)。藻菌共生體(接種量為20%)由接種口引入光生物反應器，沼液經預處理后由沼液處理器泵入光生物反應器。

圖1 實驗光生物反應器裝置

(1)不同混合光質對藻菌共生體處理沼液的影響

改變光生物反應器LED光源設置，選擇單色紅光、單色藍光、紅光：藍光(3:7、5:5和7:3)五種光質，時間設置 12 h晝/12 h夜，實驗處理7 d后測定處理后沼液中化學需氧量(COD)、總氮(TN)和總磷(TP)的濃度并計算去除率，每個實驗重復三次。

(2)不同光周期對藻菌共生體處理沼液的影響

按照(1)優選的LED混合光質和藻菌共生體，光周期選擇12 h晝/12 h夜、14 h晝/10 h夜、16 h晝/8 h夜，實驗處理 7 d后測定處理后沼液中COD、TN、TP的濃度并計算去除率，每個實驗重復三次。

1.5 實驗分析方法及數據處理

在實驗處理的不同階段，從反應體系中取15 mL混合液樣品，做離心處理(6000 rpm，10 min)。隨后用一次性PES濾膜過濾上清液，濾液放入棕色玻璃容器中保存備用。依據標準方法測定COD、TN、TP[13]。

沼液處理前后COD、TN和TP的去除率利用公式(1)進行計算：

(1)

式中：R是沼液中污染物(COD、TN和TP)的去除率，%；CI為沼液處理前污染物濃度，mg/L；CF為實驗處理不同階段沼液中污染物的濃度，mg/L。

實驗最終數據均為三個平行實驗結果數據的平均值，運用Microsoft Excel 2011進行數據分析與處理。

2 結果與討論

2.1 微藻-真菌共生體系的建立

2.1.1 藻菌比例變化對藻菌共生體形成的影響

藻菌共生體是藻和菌共同生長及結合在一起的共生體，在共生環境下菌和藻會存在相互制約，相互影響[14]。藻-菌體系共生培養7 d后，不同培養條件下構建的藻菌共生體的大小與數量結果見表1。

表1 不同比例下形成藻菌共生體的情況

從表1描述結果可以看出，當藻菌比例為1:1時，共生體系中真菌生長迅速，抑制了藻種的生長(體系顯現黃色)，且不能形成藻菌球。隨著菌種密度的提高，當藻菌比列為1:10時可形成相對大的菌絲球，但微藻的生長仍較弱(體系顯現黃色)；隨著菌種密度的進一步提高，藻、菌在共生體系中形成了同步生長現象(體系顯現深綠色)，當藻菌比列為1:20時形成了大小均勻藻菌球；當藻菌比列為1:30，會造成共生體系中微藻密度過大從而抑制真菌生長，共生體系中無法形成藻菌球。綜合考慮，1:20是藻菌共生體形成的較優比例，且成球效果最佳。

2.1.2 共培轉速變化對藻菌共生體形成的影響

按照上述優選條件(藻菌比列為1:20)，選擇了小球藻或斜生柵藻與靈芝菌分別在轉速100 rpm、160 rpm、220 rpm條件下進行藻菌共生體的培養，實驗結果如表2所示。

從表2描述結果可以看出，當共生體培養轉速為100 rpm時，共生體系能形成藻菌球，但大小不均勻(3～10 mm)；當共生體培養轉速為160 rpm時，藻、菌共生體系生長良好(體系顯現深綠色)，且形成的藻菌共生球更加均勻(3～4 mm)；當共生體培養轉速為220 rpm時，培養體系中真菌的生長受到抑制，共生體系中無法形成藻菌球。由此可見，共培時最優轉速應控制在160 rpm，此時小球藻或斜生柵藻與靈芝菌均能很好的形成藻菌共生體，且藻菌球的大小均勻，顏色深綠。

表2 不同轉速下形成藻菌共生體的情況

2.2 藻菌共生體凈化沼液結果分析

2.2.1 光質變化對藻菌共生體處理沼液的影響

改變光生物反應器LED光源設置，選擇單色紅光、單色藍光、紅光：藍光(3:7、5:5和7:3)五種光質，時間設置 12 h晝/12 h夜。在光生物反應器中通過接種藻菌共生體處理沼液，實驗處理7 d后測定處理前、后沼液中COD、TN和TP的濃度并計算去除率(每個實驗重復三次)，實驗結果見表3。

表3 不同混合光質對藻菌共生體處理沼液的影響

微藻的繁殖能力在很大程度上取決于光的波長特性，Kim等[15]的研究認為選擇合適的光源混合波長可以促進微藻的生長從而提高沼液中營養物質(COD、TN和TP)的消耗去除能力。

從表3數據可以看出，在兩種藻-菌共生體系中光質變化對沼液的處理效果會產生顯著的影響，其中混合光源的效果要好于單色光源，單色光源中單色紅光的效果又好于單色藍光。這主要是因為葉綠素和藻膽蛋白對混合光波的吸收效果更好[16]。采用柵藻-靈芝菌共生體處理沼液的體系中，沼液中COD、TN和TP的去除率均表現為紅(5):藍(5)>紅(3):藍(7)>紅(7):藍(3)>單色紅光>單色藍光；采用紅(5):藍(5)光源時，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分別為66.54%±5.69%、72.37%±6.11%、77.61%±6.21%。采用小球藻-靈芝菌共生體處理沼液的體系中，光質變化對沼液的處理效果(COD、TN)表現為紅(5):藍(5)>紅(7):藍(3)>紅(3):藍(7)>單色紅光>單色藍光；TP的去除率則表現為紅(5):藍(5)>紅(3):藍(7)>紅(7):藍(3)>單色紅光>單色藍光；采用紅(5):藍(5)光源時，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分別為71.36%±6.44%、76.24%±6.64%、79.25%±6.12%。相關研究認為微藻光系統I可以被藍光激發，而與光系統I緊密相連的光系統II則主要被紅光激發[16]。還有學者認為紅光與微藻細胞固碳有關，藍光與光合作用中甘油三酯積累酶的活性有關[17-18]。所以，當紅光與藍光的比例不合適時則會影響共生體系中微藻的光合速率，進而影響微藻的生物量[19]。而本研究結果表明，在采用不同比例的紅藍混合光源時，紅(5):藍(5)的效果最佳。此外，相比較而言小球藻-靈芝菌共生體處理沼液的效果優于柵藻-靈芝菌共生體。

2.2.2 光周期變化對藻菌共生體處理沼液的影響

選擇小球藻-靈芝菌為優勢藻菌共生體，在紅光:藍光=5:5時，光周期選擇12 h晝/12 h夜、14 h晝/10 h夜、16 h晝/8 h夜，實驗處理7 d后測定處理前、后沼液中COD、TN、TP的濃度并計算去除率(每個實驗重復三次)，實驗結果見表4。

表4 不同光周期對藻菌共生體處理沼液的影響

從表4數據可以看出，采用小球藻-靈芝菌共生體處理沼液的體系中，光周期變化對沼液的處理效果會產生顯著影響，沼液中COD、TN和TP的去除率均表現為16 h晝/8 h夜>14 h晝/10 h夜>12 h晝/12 h夜>；其中當光周期為16 h晝/8 h夜時，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分別為73.68%±5.32%、77.05%±6.25%、79.36%±5.08%。這可能主要是因為充足的光照時間能促進共生體系的繁殖，從而促進沼液中污染物質的去除。

3 結 論

藻菌共生體在沼液凈化方面展現出很好的發展前景。因此，本文圍繞藻菌共生體的構建、優勢藻菌共生體的篩選，以及藻菌共生體光生物反應器系統的調控與優化等方面進行了研究，研究結論如下：

(1)小球藻或斜生柵藻與靈芝菌的比例變化對藻菌共生體的形成會產生影響，從藻菌共生體的顏色、大小、形態看，1:20是藻菌共生體形成的最優比例；對于共生體培養轉速的影響，160 rpm下小球藻或斜生柵藻與靈芝菌均能很好的形成藻菌共生體，且形成的藻菌球大小均勻，顏色深綠。

(2)在紅光和藍光的最佳光照波長比為5:5、光周期為14 h晝/10 h夜時，小球藻-靈芝菌形成的共生體對沼液的凈化效果最佳，COD、TN和TP的去除率分別達到73.68%±5.32%、77.05%±6.25%、79.36%±5.08%。