不同方法誘導小鼠產生CD8+記憶性T細胞的研究

黃曉東 楊磊 黃清云 高雪辰

近年來記憶性T淋巴細胞在移植物免疫損傷中的作用已越來越受到人們的重視[1-2]，特別是同種移植中CD8+記憶性T細胞的作用尤受關注。有研究發現，CD8+記憶性T細胞能在極短的時間內清除再次進入到體內的抗原，發揮強大的免疫效能[3-4]。正是由于免疫反應以及免疫記憶的存在，使受體體內移植的健康器官難以長時間發揮功能甚至難以長期存活。自體移植在正常情況下，一般不會發生移植排斥反應，但是在同種異體間進行移植，常會發生不同程度的排斥反應，T細胞同樣具有特異性和記憶性，在抑制排斥反應中起關鍵作用[5-6]。免疫學相關文獻指出，不同品系小鼠之間進行皮膚移植和輸注淋巴細胞的方法可以誘導機體產生免疫排斥反應[7-8]。本研究采用兩種方法誘導小鼠機體產生免疫排斥反應，探討并比較兩種方法形成CD8+記憶性T細胞性質和數量的差異，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 受體小鼠采用4～6周齡雌性Bal B/C小鼠，共100只，體重18～20 g；提供皮片和脾臟淋巴細胞的為同一只6周齡C57小鼠，體重25 g。所有小鼠均由廣西醫科大學動物實驗中心提供。本研究動物實驗設計方案已通過廣西中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑 冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5810R）；流式細胞儀（美國 BD 公司，CannonⅡ）；流式熒光抗體 CD3-FITC、CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5（美國BD公司）；細胞培養箱（德國Thermo公司）；細胞培養相關試劑及耗材（中國四季青公司）；無菌手術器械，包括一次性方巾、眼科剪、眼科鑷、持針器、一次性6-0帶針縫合線（美國FST公司）；高壓滅菌鍋（德國Thermo公司）；1%戊巴比妥鈉（中國點滴實驗試劑有限公司）。

1.3 分組 將75只Bal B/C小鼠按隨機數字表法分為移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組、空白對照組，每組15只。

1.4 供體處理 將C57小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇5 min，在生物安全柜內應用無菌操作取背部皮片，剪成每塊約0.25 cm2，共15塊，均浸泡于放有0.9%氯化鈉溶液的平皿中并置于冰上，備用于移植組小鼠背部移植。然后將小鼠取右側臥位，皮膚表面消毒后依次剪開皮膚、腹膜，無菌操作下取出整個脾臟，將脾臟置于有0.9%氯化鈉溶液的平皿中，用2支1 ml注射器的針頭（彎成直角）在脾臟表面刺破3～5個小孔后，再輕刮脾臟表面，充分將內部組織刮出置于平皿中形成細胞懸液。將細胞懸液用冷凍離心機以1 200 r/min離心5 min，棄上清液后加入紅細胞裂解液，充分混勻后靜置10 min。重復該步驟2次后，使用200目過濾網過濾掉雜質，所得細胞懸液即為淋巴細胞懸液。用牛鮑計數板計數后分別取出1×106個、5×106個、1×107個細胞各15份，重懸于0.2 ml PBS緩沖液中，制成相應的淋巴細胞懸液并置于冰上，備用于 1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠腹腔注射。

1.5 受體處理 移植組小鼠采用1%戊巴比妥鈉0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉。剃除背部皮膚毛發后用75%乙醇消毒，并剪除約0.25 cm2，取供體皮膚在2、3、5、6、8、9、11、12 點鐘方向進行縫合，然后置于臺燈下復蘇。1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠分別注射制備好的淋巴細胞懸液0.2 ml。空白對照組小鼠腹腔注射PBS緩沖液0.2 ml。

1.6 CD8+記憶性T細胞百分比及CD3+T細胞數檢測上述處理后1、2、3個月時，5組小鼠均按隨機數字表法各取5只頸椎脫臼處死，取出脾臟制成淋巴細胞懸液，采用流式細胞儀檢測CD8+記憶性T淋巴細胞百分比及CD3+T細胞數。CD8+記憶性T細胞用CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5進行標記。4℃避光染色30 min后用 300 μl PBS洗滌細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液。重復該步驟2次，最終加入500 μl PBS重懸，上流式細胞儀檢測CD8+記憶性T細胞百分比。CD3+T細胞數檢測時采用CD3-FITC進行標記，細胞染色步驟同上，上流式細胞儀檢測后可從軟件中直接獲得細胞CD3+T細胞數。

1.7 CD8+記憶性T細胞增殖能力檢測 將剩余25只小鼠按照1.4、1.5中的方法重新制備5種小鼠模型，每組5只。在淋巴細胞產生最多的時間點（經預實驗結果顯示為2個月）處死各組小鼠，按1.4操作步驟將小鼠脾臟制成淋巴細胞懸液，進行CD8+記憶性T細胞分選、純化。具體步驟按照CD8+記憶性T淋巴細胞隱性分選試劑盒說明書操作：分別將50 μl CD8&CD44&CD62L生物素抗體與各組小鼠淋巴細胞懸液混合，孵育15 min后加入試劑盒中所配磁珠，將細胞與磁珠充分混勻后孵育15 min，過磁力架15 min，棄磁珠，所得淋巴細胞懸液重復上述步驟1次，即得CD8+記憶性T淋巴細胞。CD8+記憶性T淋巴細胞的分選純度使用流式細胞儀檢測，染色及操作步驟同上；檢測結果使用EXPO32流式軟件進行分析，所分析細胞均為CD8+細胞。隨后建立十字坐標系，橫軸指標為CD62L，縱軸指標為CD44，目的細胞CD8+記憶性T細胞表達情況為CD44+CD62L-，即落在第二象限的細胞比例為CD8+記憶性T細胞比例。

經牛鮑計數板計數后，各組取相同數目的CD8+記憶性T淋巴細胞經羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein diacetate succinimide ester，CFSE）染色，與經過輻照的C57小鼠脾臟細胞共培養，1周后采用流式細胞術檢測CFSE染色陽性細胞熒光強度，并將結果使用Modify 3.0軟件進行分析，比較5組小鼠CD8+記憶性T細胞的增殖指數，從而評價其增殖能力。

1.8 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內不同時點的比較采用單因素重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠不同時點CD8+記憶性T細胞百分比及CD3+T細胞總數的變化和比較 5組小鼠處理后1個月時CD8+記憶性T細胞百分比和CD3+T細胞總數的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。處理后2個月時，3個注射組小鼠CD8+記憶性T細胞百分比均高于移植組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中以1×106注射組百分比最高；移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組CD3+T細胞總數比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但與空白對照組比較均明顯升高（P＜0.05）；處理后 3個月時，5×106注射組CD8+記憶性T細胞百分比高于移植組，差異有統計學意義（P＜0.05），而5組間CD3+T細胞總數比較，結果同2個月時。

1×106注射組小鼠在處理后2個月時CD8+記憶性T細胞比例最高，與處理后1、3個月比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；5×106注射組、1×107注射組、移植組小鼠均在處理后3個月時CD8+記憶性T細胞比例最高，其中5×106組3個月時與1、2個月時比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠CD3+T細胞總數均在處理后2個月時最高，與1、3個月時比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠不同時點CD8+記憶性T細胞百分比及CD3+T細胞總數的變化和比較

2.2 5組小鼠CD8+記憶性T細胞增殖能力變化與比較 5組小鼠脾臟CD8+記憶性T細胞分選純化后，純度達到95.3%（圖1），達到本研究所需要求。純化后的CD8+記憶性T細胞與C57小鼠淋巴細胞共培養后，各注射組與移植組增殖指數的差異均無統計學意義（均P＞0.05）；各注射組、移植組與空白對照組比較，其增殖指數均有明顯提高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

圖1 CD8+記憶性T細胞分選、純化后純度檢測

表2 5組小鼠CD8+記憶性T細胞增殖指數的比較

3 討論

人體的免疫系統不僅具有實時免疫功能，同時也存在免疫記憶功能[9]，即在抗原初次對機體進行刺激時，促使一系列免疫細胞增殖、活化，進而發揮免疫功能[10]，如T淋巴細胞、B淋巴細胞以及漿細胞等，在抗原完全被清除后，會形成少量具有記憶功能的免疫細胞儲存在機體免疫器官中，如CD8+T細胞，通常會在外界抗原入侵機體后1周左右達到高峰[11]。隨后，在抗原被完全清除后，大部分效應性CD8+T細胞凋亡，并被脾臟所破壞，少部分則逐漸分化成為能夠長期存活的記憶性T細胞[12]。記憶性T細胞無論是在器官移植排斥和抗腫瘤過程中，均發揮著至關重要的作用，同時也是移植免疫和腫瘤免疫領域的研究熱點。近年來，關于記憶性T細胞的研究越來越多。由于機體在正常狀態下細胞免疫未受到激活，記憶性T細胞在機體內含量十分低。因此，如何獲取足夠的記憶性T細胞，是進行記憶性T細胞研究的一個重要且困難的環節[13]。

本研究將傳統的應用皮膚移植誘導CD8+記憶性T細胞的方法，與新的方法，即對小鼠進行同種異基因脾臟淋巴細胞注射誘導CD8+記憶性T細胞的方法進行了比較。結果發現，處理后2個月時最高CD8+記憶性T細胞比例可達到（42.28±2.74）%，高于傳統的移植組；處理后3個月時，各注射組小鼠脾臟中CD8+記憶性T細胞百分比最高達到（56.57±1.28）%，而此時小鼠開始逐漸進入免疫記憶階段，體內的CD3+T細胞總數開始下降，因此建議選取注射1×106個細胞，誘導時間為2個月，此時產生的CD8+記憶性T細胞百分比相對較高，CD3+T細胞總數較多，誘導周期相對較短，效果令人滿意。同時，各注射組、移植組與空白對照組比較，CD8+記憶性T細胞增殖指數均有明顯提高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

綜上所述，記憶性T細胞通常以低水平存在于脾臟及外周血中，本研究所采用的方法有助于獲取足夠的記憶性T細胞，在進行記憶性T細胞的課題研究中具有一定的應用價值。