腸道菌群多樣性變化與阻塞性睡眠呼吸暫停合并高血壓發(fā)病的關(guān)系研究

汪飛 唐婷玉 劉娟 黃河 李志軍

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）由于上呼吸道完全或部分阻塞，反復(fù)出現(xiàn)睡眠呼吸暫停及睡眠結(jié)構(gòu)紊亂，可導(dǎo)致間歇低氧和睡眠片段化，是高血壓、腫瘤、糖尿病等疾病的獨(dú)立危險因素，影響患者的生活質(zhì)量甚至縮短壽命[1]。流行病學(xué)研究表明，OSA在成人中的發(fā)病率為26%，且近年來隨著肥胖人數(shù)的增加而逐漸升高[2]。目前，OSA被認(rèn)為是全身性高血壓的重要危險因素，約50%OSA患者存在高血壓[3]。已有研究證實(shí)OSA與高血壓之間關(guān)系密切[4]，至于OSA引起高血壓的機(jī)制仍不十分清楚，但近年來越來越多的研究開始關(guān)注腸道菌群改變引起OSA導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。目前關(guān)于有效治療OSA仍存在以下困難：（1）臨床上缺乏療效確切的治療藥物；（2）無創(chuàng)通氣作為OSA的一線治療方法存在患者依從性差的問題；（3）口腔矯正器也是如此，而且約80%患者治療后存在唾液多、口腔干燥、顳下頜關(guān)節(jié)疼痛和牙齒不適感等不良反應(yīng)；（4）部分患者雖可采取手術(shù)治療，但遠(yuǎn)期療效欠佳。因此，臨床治療OSA合并高血壓仍有一定的難度。本研究旨在探討腸道菌群多樣性改變與OSA合并高血壓發(fā)病的關(guān)系，為篩選特異性腸道微生物作為潛在的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2018年7月至2021年6月浙江醫(yī)院睡眠障礙中心收治的鼾癥患者46例，均已接受夜間多導(dǎo)睡眠圖（polysomnography，PSG）監(jiān)測。依據(jù)PSG結(jié)果分為OSA組32例和對照組14例，其中對照組無其他重大基礎(chǔ)疾病，OSA組除高血壓外無其他重大基礎(chǔ)疾病。根據(jù)是否合并高血壓，將OSA組分為OSA合并高血壓患者11例及單純OSA患者21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)中國醫(yī)師協(xié)會睡眠醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會制定《成人阻塞性睡眠呼吸暫停多學(xué)科診療指南（2018年版）》，PSG檢查提示呼吸暫停低通氣指數(shù)（apneahypopnea index，AHI）≥5，同時伴有典型的夜間睡眠打鼾伴呼吸暫停、日間嗜睡便可診斷OSA[1]；（2）根據(jù)《中國高血壓防治指南2018年修訂版》，在未使用降壓藥物的情況下，診室收縮壓（SBP）≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓（DBP）≥90 mmHg便可診斷高血壓[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18 周歲；（2）頜面部嚴(yán)重畸形；（3）患有可影響血氧飽和度的相關(guān)疾病，如慢性阻塞性肺疾病、心功能不全等；（4）患有可能會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或影響炎癥因子分泌的相關(guān)疾病，如炎癥性腸病、糖尿病、腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病等；（5）正在服用可影響睡眠的藥物，如苯二氮卓類藥物、鎮(zhèn)靜劑等；（6）已經(jīng)進(jìn)行 OSA相關(guān)治療；（7）PSG睡眠時間＜5 h；（8）近2周內(nèi)接受益生菌、抗生素或免疫抑制劑治療。OSA合并高血壓組均為男性，平均年齡（40.5±10.2）歲；單純OSA組男19例，女 2例，平均年齡（37.9±10.4）歲；對照組男 5例，女 9例，平均年齡（42.3±10.3）歲；3組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但性別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PSG監(jiān)測 采用SOMNO screen plus PSG+（V5）（德國施曼諾公司）多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀監(jiān)測，監(jiān)測時間≥5 h。記錄AHI、微覺醒指數(shù)、最低血氧飽和度、平均血氧飽和度及氧減指數(shù)。

1.2.2 腸道菌群檢測及分析 于PSG監(jiān)測結(jié)束后當(dāng)日清晨收集3組患者的糞便，采用QIAamp DNA Stool Mini試劑盒（德國 Qiagen公司，型號：Qiagen51604），按照試劑盒說明書提取糞便總細(xì)菌DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Σ杉臉颖綝NA進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物并放入NGS測序儀（美國Illumina公司，型號：MiSeq PE300）進(jìn)行測序、建庫、簇制備和比對，獲得菌群信息。經(jīng)過篩選，最終單樣本序列數(shù)超過40 000條。將相似度＞97%的序列歸為同一個分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU），最終產(chǎn)生759個OTU。采用韋恩圖分析3組患者OTU的差異。α多樣性分析用來評估菌群的豐度和多樣性，β多樣性分析用來評估3組樣本的菌群多樣性差異。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）比較3組患者樣本菌群組成差異，以三維坐標(biāo)圖呈現(xiàn)。坐標(biāo)圖上三點(diǎn)距離越近，代表樣本菌群組成越相似。通過Metastats分析在不同水平上比較3組患者菌群的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0和R24、GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析多樣性指數(shù)的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者PSG監(jiān)測結(jié)果的比較 3組患者在AHI、微覺醒指數(shù)、最低血氧飽和度、平均血氧飽和度及氧減指數(shù)的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），OSA合并高血壓組、單純OSA組各項(xiàng)監(jiān)測指標(biāo)均高于對照組，OSA合并高血壓組最低血氧飽和度、平均血氧飽和度低于單純OSA組，其余指標(biāo)均高于單純OSA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組患者PSG監(jiān)測結(jié)果比較

2.2 3組患者OTU的差異 3組共有402個OTU，單純OSA組與對照組共有84個OTU，OSA合并高血壓組與對照組共有24個OTU，OSA合并高血壓組與單純OSA組共有48個OTU，OSA合并高血壓組有34個特有OTU，單純OSA組有86個特有OTU，對照組有81個特有OTU，見圖1。

圖1 韋恩圖分析3組患者OTU的差異

2.3 菌群積累情況與菌群多樣性分析 根據(jù)樣本數(shù)量和菌群，α多樣性分析（Rank豐度分布曲線、樣本稀疏曲線、香農(nóng)曲線和菌群積累曲線）提示隨著樣本數(shù)量的增加，菌群的多樣性和豐度并沒有明顯的增加，表明目前的樣本量能夠反映菌群多樣性豐富程度，所有樣本的菌群積累曲線見圖2（插頁）。3組患者腸道微生物菌群的多樣性和豐度（主要包括Observed指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)）見圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OSA合并高血壓組及單純OSA組患者腸道菌群的多樣性和豐度降低了，但3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PCA分析表明，OSA合并高血壓組、單純OSA組腸道菌群發(fā)生改變（圖4，見插頁）。

圖2 菌群積累曲線（a：Rank豐度分布曲線用來反映菌群豐度和多樣性；b：稀疏曲線用來反映菌群的豐度；c：香農(nóng)指數(shù)反映菌群的多樣性；d：菌群積累曲線用來反映菌群的豐度）

圖3 3組患者腸道微生物菌群的多樣性和豐度分析

圖4 3組患者糞便菌群的PCA分析

2.4 菌群差異分析 對3組患者所有樣本進(jìn)行分類，選取菌群豐度最高的30個菌群，分析門、綱、目、科、屬、種水平上的分布差異。結(jié)果顯示，門水平Bacteroidetes在對照組中豐度高于OSA合并高血壓組、單純OSA組，而Firmicutes豐度在OSA合并高血壓組占比最高；綱水平Bacteroidia在對照組中豐度最高，而Clostridia在OSA合并高血壓組中豐度最低；目水平Bacteroidales在對照組中豐度最高，而Clostridiales在OSA合并高血壓組中豐度最低；科水平Bacteroidaceae、Ruminococcaceae在對照組中豐度最高，Prevotellacea在單純OSA組中豐度最高，而Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Enterobacteriaceae 在 OSA合并高血壓組中豐度最高；屬層級Bacteroides在對照組中豐度最高、Lachnospiracea_incertae_sedis、Clostridium_XlVa、Blautia在OSA合并高血壓組中豐度最高，Prevotella在單純OSA組中豐度最高。Metastats分析結(jié)果顯示，對照組、單純OSA組及OSA合并高血壓腸道菌群差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。在門水平上，對照組的Bacteroidetes豐度最高，F(xiàn)irmicutes顯著降低；而OSA合并高血壓組的Firmicutes最高，Bacteroidetes豐度顯著降低。在綱水平上，Bacteroidia在對照組中豐度最高而在OSA合并高血壓組中豐度最低。在目水平上，Bacteroidales在對照組中豐度最高而Actinomycetales在OSA合并高血壓組中豐度最低。在科水平上，Rikenellaceae在對照組中豐度最高，而Micrococcaceae、Clostridiaceae_1、Carnobacteriaceae 在OSA合并高血壓組中豐度最高。在屬水平上，Alistipes在對照組中豐度最高而 Rothia、Scardovia、Clostridium_sensu_stricto、Granulicatella、Weissella、Blautia在 OSA合并高血壓組中豐度最高。在種水平上，Alistipes_shahii、Clostridium_leptum、Alistipes_indistinctus、Bacteroides_massiliensis、Ruminococcaceae_bacterium_GD6在對照組中豐度最高，而Scardovia_wiggsiae在OSA合并高血壓組中豐度最高。

3 討論

近年來的研究表明，腸道微生物的變化與多種慢性疾病有關(guān)。Fang等[6]研究發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病患者腸黏膜相關(guān)菌群發(fā)生改變，也有研究報(bào)道腸道微生態(tài)組成和代謝改變可以用來評估強(qiáng)直性脊柱炎等疾病的發(fā)生和發(fā)展[7]。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，腸道菌群失調(diào)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血壓升高[8]。另有研究表明，腸道微生態(tài)改變可使促炎因子增多，抑炎因子減少，導(dǎo)致高血壓的發(fā)生[9]。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注OSA與腸道菌群的關(guān)系。有動物模型研究發(fā)現(xiàn)OSA大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變[10]。本研究顯示OSA患者腸道菌群發(fā)生改變，與上述研究結(jié)果相符。

現(xiàn)今較多研究顯示OSA可出現(xiàn)腸道菌群種類及結(jié)構(gòu)的改變，但關(guān)于OSA腸道菌群結(jié)構(gòu)改變特點(diǎn)，目前暫無公認(rèn)的科學(xué)研究證實(shí)。Moreno-Indias等[11]通過OSA動物模型研究發(fā)現(xiàn)OSA大鼠出現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著改變，主要表現(xiàn)為厚壁菌門豐度增多，擬桿菌及變形菌門豐度減少。Poroyko等[12]研究揭示慢性睡眠中斷可導(dǎo)致腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)改變。本研究發(fā)現(xiàn)OSA患者與對照組相比，腸道微生物群發(fā)生改變，Bacteroidetes在對照組人群中豐度較高，而Firmicutes在OSA人群中豐度較高，與上述研究報(bào)道一致。

雖然OSA與高血壓之間的關(guān)系已經(jīng)得到了明確的證實(shí)，但對于OSA如何導(dǎo)致高血壓卻知之甚少。有研究顯示，OSA會導(dǎo)致高血壓的發(fā)生，經(jīng)過持續(xù)氣道正壓通氣治療后血壓會有所下降[13]。近年來的研究表明，腸道微生物群改變在OSA合并高血壓的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的調(diào)節(jié)作用[14]。有實(shí)驗(yàn)表明，腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致高血壓的發(fā)生、發(fā)展[15]。Mashaqi等[16]報(bào)道了腸道菌群失調(diào)介導(dǎo)OSA大鼠發(fā)生全身性高血壓，并且認(rèn)為腸道菌群改變是OSA合并高血壓病理生理學(xué)的重要因素。Durgan等[17]在OSA大鼠模型中進(jìn)行的研究揭示，腸道菌群失調(diào)參與了OSA合并高血壓的發(fā)生，而且發(fā)現(xiàn)與對照組相比，OSA大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，表明腸道菌群失衡在OSA合并高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，在門、綱、目水平上，OSA合并高血壓組與單純OSA組、對照組相比，F(xiàn)irmicutes豐度最高，Bacteroidetes豐度顯著降低，存在Bacteroidetes/Firmicutes菌群紊亂，與以上研究結(jié)果相似。Bacteroidetes和Firmicutes是腸道微生物的兩大重要類群，Bacteroidetes/Firmicutes比值的紊亂可導(dǎo)致腸道屏障破壞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本研究還顯示在科、屬、種水平上，OSA合并高血壓組存在其它一些腸道菌群結(jié)構(gòu)異常，以往文獻(xiàn)及研究較少報(bào)道，但可能提示參與OSA合并高血壓的發(fā)生、發(fā)展，由于該研究為單中心臨床試驗(yàn)，納入的臨床病例數(shù)非常有限，該結(jié)論需要進(jìn)一步研究以明確。因此，未來還需要開展多中心前瞻性臨床對照試驗(yàn)，進(jìn)一步分析論證。

本研究也存在一些不足之處。首先，本研究為單中心臨床研究，且樣本量偏少，然而目前的樣本量能夠反映菌群豐富程度，且PCA分析及Metastats分析結(jié)果均顯示對照組、單純OSA組及OSA合并高血壓腸道菌群差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），故仍能表明OSA合并高血壓患者發(fā)生腸道菌群多樣性改變。其次，本研究僅觀察了對照組、單純OSA組及OSA合并高血壓腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，未能進(jìn)一步對OSA患者進(jìn)行無創(chuàng)呼吸機(jī)治療并治療前后腸道菌群多樣性的變化，尤其是針對OSA合并高血壓患者，需要進(jìn)一步研究證實(shí)腸道菌群多樣性改變與OSA及高血壓之間的因果關(guān)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Firmicutes在OSA合并高血壓人群中豐度最高，Bacteroidetes在對照組中豐度較高；腸道菌群多樣性改變參與OSA合并高血壓的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果為未來將調(diào)節(jié)腸道微生物群紊亂作為治療OSA合并高血壓提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。