NLRP3炎性小體在慢性氣道炎癥性疾病中的作用研究進展

鄒進晶，陳國忠

武漢大學人民醫院呼吸與危重癥醫學科，武漢 430060

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族含熱蛋白結構域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domaincontaining protein 3，NLRP3)炎性小體是機體固有免疫的重要組成部分，可識別細胞內病原相關分子模式或損傷相關分子模式，介導多種細胞因子的加工、成熟及釋放，包括白細胞介素(interleukin，IL)-1β及IL-18，直接參與調控多種慢性炎癥性疾病的發生發展[1-3]。NLRP3炎性小體主要由NLRP3、凋亡相關的斑點樣蛋白(apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)組成。NLRP3蛋白能感知信號刺激并作為支架蛋白結合ASC，ASC招募并水解caspase-1前體(pro-caspase-1)，形成具有酶活性的caspase-1，促進IL-1β及IL-18等炎性因子的加工、成熟及釋放[4]。本文就NLRP3炎性小體的活化機制及其在慢性氣道炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和哮喘中的作用綜述如下。

1 NLRP3炎性小體

1.1 NLRP3炎性小體活性調控 NLRP3炎性小體的活性調控可通過多種方式實現，如通過細胞膜表面Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)或細胞因子受體[如腫瘤壞死因子受體、IL-1受體(IL-1 receptor，IL-1R)]激活下游核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，直接促進NLRP3及IL-1β前體(pro-IL-1β)轉錄，在轉錄水平激活NLRP3炎性小體。目前認為NLRP3炎性小體活化還與離子流、溶酶體損傷及細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成有關(圖1)。

圖1 NLRP3炎性小體活性調控過程Fig.1 Regulation of NLRP3 inflammasome activity

1.1.1 離子流 胞漿離子濃度改變與NLRP3炎性小體的功能密切相關。研究顯示，細胞內K+減少及Ca2+增加均可改變NLRP3炎性小體的活性。由于細胞損傷或其他原因造成細胞外三磷酸腺苷(extracellular adenosine triphosphate，eATP)水平升高，可與嘌呤能P2X7受體結合，觸發K+快速外流，導致代償性Ca2+內流以及細胞膜縫隙連接蛋白半通道蛋白Pannexin-1開放，后者能介導多種小分子物質進入細胞內，從而直接激活NLRP3炎性小體[5]。除ATP外，穿孔素也可直接在細胞膜上打孔，造成細胞內K+外流并促進細胞外脂多糖等分子進入細胞內，從而刺激NLRP3炎性小體活化。細胞膜表面的鈉鉀泵是向細胞內泵入K+的關鍵機制之一，抑制鈉鉀泵可降低細胞內K+水平，從而激活NLRP3炎性小體[6]。但目前K+外流引起NLRP3炎性小體激活的具體機制尚不明確。Iyer等[7]認為，K+外流可能促進線粒體膜脂質心磷脂釋放，并與NLRP3蛋白C末端富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat，LRR)結構域結合，進而激活NLRP3炎性小體。此外，細胞內Ca2+增加也與NLRP3炎性小體激活有關。Ca2+可與細胞膜表面的鈣敏感受體結合，促進磷脂酶C催化細胞膜上的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇生成1, 4, 5-三磷酸肌醇，后者與其特異性受體結合，進一步促進內質網Ca2+釋放進入細胞質；Ca2+還可直接促進NLRP3與ASC的結合，從而激活NLRP3炎性小體[8]。

1.1.2 溶酶體損傷 晶體物質(如尿酸鹽、草酸鈣、硅、鋁等)及纖維蛋白(如β-淀粉樣蛋白)能被免疫細胞吞噬，破壞細胞溶酶體穩定性及膜通透性，釋放溶酶體內多種組織蛋白酶(如組織蛋白酶B、L、C、S等)，進而激活NLRP3炎性小體[8]。直接應用組織蛋白酶B抑制劑能減弱NLRP3炎性小體的活化及caspase-1活性；而應用質子泵抑制劑抑制酸依賴的溶酶體蛋白酶也能明顯抑制NLRP3炎性小體的活化過程[10]。目前，溶酶體損傷影響NLRP3炎性小體激活的具體機制尚不明確。有研究顯示，溶酶體釋放的組織蛋白酶能水解并降低NLRP3炎性小體內源性抑制因子水平，或直接作為配體發揮對NLRP3炎性小體的活化作用[11]。此外，溶酶體破裂還會釋放Ca2+，促進ASC寡聚化及其與NLRP3的結合，從而激活NLRP3炎性小體[12]。

1.1.3 細胞內ROS形成 細胞內ROS可使硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，T X N I P)與硫氧還蛋白解離，并促進T X N I P 與NLRP3的LRR結構域結合，從而解除LRR依賴的NLRP3自身抑制作用。線粒體是細胞內ROS的重要來源，線粒體ROS可刺激NLRP3定位到線粒體相關內質網膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAM)，同時ASC也被招募至MAM，與NLRP3、pro-caspase-1等一起組裝形成NLRP3炎性小體[13]。應用ROS清除劑或NADPH氧化酶抑制劑能明顯阻斷NLRP3炎性小體的活化。

與NLRP3炎性小體激活過程相似，其活性抑制機制也十分復雜。雌激素及鋅指蛋白GFⅡ等可直接抑制NF-κB活性，在轉錄水平減少NLRP3的轉錄，而miR-223能直接與NLRP3mRNA的3'-非翻譯區結合，在轉錄后水平促進NLRP3mRNA降解[14-15]。細胞內cAMP通過與NLRP3的核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)相互作用，而一氧化氮則通過誘導NLRP3亞硝基化干擾NLRP3炎性小體組裝，從而阻止其活化[16-17]。此外，細胞內一氧化氮還能促進損傷線粒體的清除，從而抑制NLRP3炎性小體的激活[18]。

1.2 N L R P 3 炎性小體的肺內表達 既往有關NLRP3炎性小體的研究大多集中于骨髓來源的巨噬細胞或樹突狀細胞，但Guarda等[19]應用熒光示蹤技術發現，肺是除脾臟以外NLRP3表達水平最高的組織。肺內高水平NLRP3表達可能與肺內存在的大量免疫細胞有關。事實上，肺泡巨噬細胞及樹突狀細胞中NLRP3表達水平很高，是肺組織IL-1β及IL-18的主要來源。此外，肺上皮細胞也表達NLRP3并在應激刺激下分泌IL-1β[20]。肺內高水平的NLRP3炎性小體表達與肺內炎癥反應密切相關，下面將對NLRP3在COPD及哮喘這兩種慢性氣道炎癥性疾病中的研究進展進行綜述。

2 NLRP3炎性小體與常見慢性氣道炎癥性疾病

2.1 COPD COPD是一種不完全可逆的以持續性氣流受限為主要特征的慢性進行性肺病，可逐漸發展為肺源性心臟病及呼吸衰竭。COPD的確切原因目前尚不明確，但大量研究證實，氣道免疫炎癥反應與COPD的發生發展關系密切。吸入有毒有害顆粒或氣體(主要為吸煙)是COPD發生及氣道炎癥加劇的重要原因。這些有毒有害顆粒或氣體作用于肺內上皮細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞等，加速炎性因子、ROS及組織降解酶的合成釋放，促進炎癥發展及肺結構破壞。既往研究發現，吸入的有毒有害顆粒或氣體可直接激活肺內模式識別受體(主要為TLR)，進而激活下游NF-κB信號通路，促進NLRP3及相關炎性因子的轉錄。此外，這些有毒有害顆粒或氣體還會引起肺內細胞大量死亡，釋放多種內源性危險分子，如高遷移率族蛋白B1等，進一步促進TLR及下游NLRP3的活化[21]。由于胞外核苷酸酶的存在，eATP常處于較低水平，但對于COPD患者，由于胞外核苷酸酶表達下調或上皮及白細胞來源的ATP增多，導致eATP水平升高，進而通過P2X7受體激活NLRP3炎性小體。而且，eATP還能通過P2X7受體促進炎癥細胞趨化及活化，進一步加重肺內炎癥反應[22]。有研究顯示，COPD患者肺內ATP水平與肺功能及炎癥水平顯著相關[23]。

氧化應激是NLRP3炎性小體活化的另一關鍵機制。大量研究證實，在COPD發生及加重過程中，肺內ROS水平顯著增高；氣道免疫細胞浸潤還會進一步增加肺內氧自由基的產生及氧化應激反應。尿酸單鈉晶體也是NLRP3活化的重要分子，可被肺泡巨噬細胞攝取，直接誘導NLRP3炎性小體活化，而敲除NLRP3可抑制小鼠IL-1β的產生及炎癥細胞浸潤。大量研究證實，COPD患者的肺泡灌洗液中尿酸水平顯著升高，提示尿酸也可能參與調控NLRP3的活化[24]。此外，COPD患者肺組織caspase-1活性、IL-1β及IL-18等炎性因子水平也顯著增高，提示NLRP3炎性小體在COPD發生發展過程中被激活。

目前關于NLRP3炎性小體在COPD進展中作用的研究較少。Lappalainen等[25]發現，肺上皮細胞特異性過表達IL-1β的小鼠肺內中性粒細胞及巨噬細胞浸潤增多，肺泡間隔彈力纖維被嚴重破壞，氣道壁發生纖維化，肺遠端小氣道出現擴張，表現出與COPD相似的病理改變及功能障礙。敲除IL-1R或應用IL-1β中和抗體能阻斷吸煙引起的肺病理改變[26]。此外，過表達IL-18也可增加小鼠肺內炎癥水平，促進小鼠肺氣腫及肺動脈高壓形成，與COPD的臨床表現一致；而敲除IL-18受體則能顯著減輕吸煙引起的小鼠肺損傷及炎癥反應[27-28]。同樣，應用caspase-1特異性抑制劑也能減少吸煙誘導的小鼠肺內炎癥細胞浸潤，并降低血清炎性因子IL-1β、TNF-α水平[29]。Eltom等[30]研究發現，使用P2X7受體選擇性抑制劑或敲除P2X7受體能抑制吸煙誘導的小鼠caspase-1活化及IL-1β釋放，減少氣道中性粒細胞浸潤并緩解小鼠COPD癥狀。但Pauwels等[26]分別應用NLRP3及caspase-1敲除小鼠進行研究卻發現，吸煙引起的肺內炎癥損傷與NLRP3及caspase-1無關。

2.2支氣管哮喘 支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分引起的氣道慢性炎癥及高反應性[31]，主要表現為廣泛而多變的可逆性呼氣氣流受限。研究顯示，哮喘致病源塵螨可促進巨噬細胞、上皮細胞及樹突狀細胞釋放ATP，激活NLRP3炎性小體，增強氣道炎癥反應；在哮喘患者肺內也可檢測到較高的ATP及其受體P2X7水平[32]。過敏原吸入還會促進氣道ROS的產生，進一步激活NLRP3炎性小體，增加IL-1β和IL-18的成熟及釋放。此外，二氧化硅及石棉等還能促進NLRP3炎性小體組裝，以增加其活性[33]。研究顯示，卵清蛋白引起的哮喘小鼠的血清中淀粉樣蛋白A水平顯著升高，可直接激活NLRP3炎性小體，加重哮喘癥狀[34]。在卵清蛋白及氧化鋁誘導的小鼠哮喘模型中可檢測到caspase-1活性及IL-1β水平升高，且氣道IL-1β水平與caspase-1活性呈正相關[35]。在哮喘患者痰液中也可檢測到高水平的IL-1β，并與病情嚴重程度密切相關[36]。但也有研究發現，在兒童急性哮喘及哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中IL-18水平明顯降低[37-38]。

中和肺內ATP或應用非選擇性嘌呤能受體拮抗劑可減輕卵清蛋白及氧化鋁誘導的哮喘小鼠氣道嗜酸性粒細胞浸潤、杯狀細胞增生及氣道高反應性[39]。應用caspase廣譜抑制劑也可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應[32]。通過重組腺病毒過表達IL-1受體拮抗劑或直接敲除IL-1α/β能顯著降低過敏原引起的小鼠氣道高反應性，以及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞附著，而且氣道周圍炎癥也得以減輕[40-41]。Th2細胞與支氣管哮喘的關系密切，可通過致敏嗜酸性粒細胞而增高氣道反應性。敲除NLRP3、ASC或caspase-1可抑制Th2細胞活化，減少氣道嗜酸性粒細胞及Th2細胞釋放相關炎性因子；相應地，敲除IL-1β或IL-1R也可明顯抑制小鼠氣道Th2細胞活化[42-43]。但Kool等[44]卻認為，NLRP3與卵清蛋白或塵螨引起的氣道炎癥反應無關。Allen等[45]使用4種不同的過敏性哮喘模型也證實，敲除NLRP3不影響小鼠氣道過敏反應。這些差異可能與過敏原類型、濃度、給藥方式及宿主微生物組成不同有關，但NLRP3在哮喘中的作用還需進一步研究。IL-18可以促進Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-9及IL-13，肺特異性過表達IL-18可增加卵清蛋白誘導的哮喘小鼠氣道T細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤及高反應性，應用抗CD4抗體處理或敲除IL-13則能改變小鼠的氣道炎癥及哮喘癥狀[46]。反之，敲除IL-18可顯著緩解卵清蛋白或氧化鋁誘導的小鼠哮喘癥狀[47]。也有研究發現，IL-18與哮喘的發生無關，甚至可以抑制哮喘的進展[48-49]。

3 總結與展望

NLRP3炎性小體是機體固有免疫的重要組成部分，與多種慢性炎癥性疾病的發生發展關系密切。NLRP3炎性小體在肺內高表達，參與調控COPD及哮喘等慢性氣道炎癥性疾病的進展。目前關于NLRP3炎性小體在上述疾病中作用的研究較少，其機制也尚未完全明確，如慢性氣道炎癥性疾病進展過程中NLRP3炎性小體活化的具體方式是在轉錄水平發生，還是依賴于經典的離子流、溶酶體損傷或細胞內ROS等仍需進一步探討。此類疾病進展通常涉及多種細胞類型，NLRP3炎性小體主要表達于肺內何種細胞，在不同類型細胞中對病情進展的影響是否一致也不明確。后續研究可通過譜系追蹤實驗及細胞特異性轉基因小鼠探討NLRP3炎性小體在不同慢性氣道炎癥性疾病發生發展中的作用。