骨保護素保護關節軟骨細胞作用機制研究

高智 徐洪偉 徐宏光 張曉玲 馬明明 徐永明

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis,KOA）是老年退變性疾病中最常見的炎癥性疾病之一，發病率逐年升高，發病年齡呈年輕化趨勢[1-2]。研究表明我國40歲以上人群KOA的發病率已達15.6%，KOA引發的疼痛困擾著約8.1%的國人[3-4]。KOA的主要病理特征表現為關節軟骨退變和損傷，它可以導致關節疼痛、活動受限、甚至關節畸形等，最終導致關節活動能力喪失[5-6]。因為KOA病因不明，目前尚無特效藥物能夠治療[6]。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6 等細胞因子直接或間接參與關節的炎癥反應及退變進程，并最終引起關節軟骨和滑膜的破壞，導致KOA的發生[7-8]。NF-κB信號通路在調控關節軟骨細胞的炎癥中處于主導地位[9-10]。有研究表明，骨保護素（osteoprotegerin,OPG）在一定程度上能緩解KOA的病情，但其具體作用機制尚不明確[11-12]。OPG能競爭性阻斷NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）與其受體的相互結合，調控NF-κB信號通路，抑制破骨細胞進一步分化成熟，最終導致破骨細胞發生凋亡[13]。OPG是否通過調控NF-κB信號通路延緩關節軟骨的破壞值得進一步研究。本研究團隊前期使用FX-5000TM細胞體外力學刺激裝置建立模型，對體外培養的關節軟骨細胞應用不同力學試驗，選取合適的力學刺激及頻率（在不影響細胞存活率的情況下關節軟骨細胞逐漸開始退變）作用關節軟骨細胞引起NF-κB信號通路的激活并使關節軟骨細胞退變[14]。本研究在此模型基礎上進一步研究OPG保護關節軟骨細胞的具體作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級SD成年大鼠8只，7周齡，體重（140±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供［SCXK（滬）2014-0002］。大鼠飼養環境嚴格遵守《實驗動物管理條例》，專用鼠類動物飼養籠內飼養，自由進食復合型鼠糧，自由飲水，室溫控制在24℃左右，12 h光照12 h黑暗交替。所有操作均符合中國科學院上海生命科學院動物實驗研究相關倫理學要求。

1.2 試劑和儀器 二型膠原酶（美國Sigma公司，批號：C6885）；胰蛋白酶（美國 Gibco公司，批號：R001100）；FBS（美國 Gibco 公司，批號：10099）；DMEM/F12（美國 Hyclone公司，批號：SH30023.01B）；OPG（美國Minneapolis公司，批號：CB35786656）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號：15596026）；Real-Time PCR 試劑盒（中國TOYOBO公司，批號：QPK-201）；細胞核蛋白提取試劑盒（中國生工公司，批號：C50009）；兔抗鼠磷酸化 p65（p-p65）抗體（美國 Cell Signaling Technology公司，批號：3036）；兔抗鼠p65抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號：9460）；兔抗鼠基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）抗體（美國 Bioworld Technology公司，批號：BS1231）；山羊抗兔二抗（美國Bioworld Technology公司，批號：BS10003）；細胞計數儀（美國Invitrogen公司，型號：countess3）；超微量分光光度計（美國Thermo＆ Scientific公司，型號：NanoDrop 2000）；WB 凝膠成像系統（中國 Tanon公司，型號：T1600）；Real-Time PCR 儀（德國Roche公司，型號：Roche LightCycler480）；TaKaRa反轉錄試劑盒（日本 TaKaRa公司，批號：6210A-1）；細胞體外力學刺激裝置（美國Flexcell公司，型號：Flexcell FX-5000TM）；表面附著鼠尾膠原的BioFlexTM6孔多向加力板（美國Fexcell公司，型號：BF-4002C）。

1.3 分離培養大鼠原代膝關節軟骨細胞 取8只清潔級SD大鼠，頸椎脫臼法處死后消毒，于負壓超凈臺內取出關節軟骨，剪碎，胰蛋白酶恒溫震蕩消化30 min，含10%FBS的DMEM/F12培養液終止消化，PBS仔細清洗后加入0.2%二型膠原酶消化，消化期間，每隔約15 min輕輕震蕩培養皿1次，6 h后將培養皿內液體倒入70目的濾篩中過濾離心后均勻播種于10 cm培養皿內，用含10%FBS的DMEM/F12培養液培養傳代至P2代進行實驗。

1.4 實驗分組 將P2代大鼠關節軟骨細胞隨機分為對照組、間歇性循環牽張力（intermittent cyclic mechanical tension,ICMT）加力組（ICMT組）、OPG組、ICMT 3 d+OPG組。對照組：在含10%FBS的DMEM/F12細胞培養液的BioFlexTM6孔多向加力板上接種培養關節軟骨細胞，在37℃、5% CO2的培養箱中培養，培養3 d；其他各組基礎培養條件均與對照組相同。ICMT組：將接種后的細胞放置在細胞體外力學刺激裝置內，設置加力參數：8%壓強的ICMT，0.5 Hz，10 h/d，即0.5 Hz頻率，8%壓強的ICMT對細胞每天力學刺激10 h，對細胞加力1 d設為ICMT 1 d組，加力2 d設為ICMT 2 d組，加力3 d設為ICMT 3 d組。OPG組：使用含濃度為5、10、20 ng/ml OPG的細胞培養液分別處理關節軟骨細胞，根據OPG濃度設為5 ng OPG組、10 ng OPG組和20 ng OPG組，培養時間為3 d。ICMT 3 d+OPG組：在對細胞進行加力前3 h使用含濃度為5、10、20 ng/ml OPG的細胞培養液分別處理關節軟骨細胞，分別設為ICMT 3 d+5 ng OPG組、ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組。

1.5 關節軟骨細胞形態學觀察 采用甲苯胺藍染色法。取對照組、ICMT 3 d組、ICMT 3 d+20 ng OPG組軟骨細胞。PBS洗滌細胞2次，4%多聚甲醛固定細胞，適量的甲苯胺藍染色細胞1 h，晾干后用倒置相差光學顯微鏡進行觀察并拍照。觀察染色前各組細胞形態學變化及染色后各組細胞表型的變化。

1.6 細胞存活率檢測 采用四噻唑藍[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl） -2,5-diphenyltetrazolium bromide，MMT]法。將對照組、ICMT 1 d 組、ICMT 2 d 組、ICMT 3 d組、5 ng OPG組、10 ng OPG組和20 ng OPG組關節軟骨細胞分別接種在96孔板中培養，各孔加入100 μl MTT并孵育4 h后用DMSO處理細胞。酶標儀測定各孔波長630 nm處吸光度（OD）值。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.7 關節軟骨細胞中二型膠原、蛋白聚糖、SRY相關高遷移率族盒蛋白9（SRY-related high-mobility-group box gene 9，SOX-9）、MMP-13 mRNA 表達水平檢測采用RT-PCR法。取對照組、ICMT 1 d組、ICMT 3 d組、ICMT 3 d+5 ng OPG組、ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組關節軟骨細胞，分別在各細胞培養孔中加入1 ml Trizol，充分裂解后，提取RNA，30 μl DEPC水溶解RNA，Nano-Drop 2000超微量分光光度計檢測RNA的純度，選取合格樣品（RNA OD260/OD280值為 1.8～2.0）。取 1 μg關節軟骨細胞的 RNA，按照20 μl反轉體系反轉成cDNA，用稀釋10倍的cDNA進行RT-PCR。RT-PCR擴增體系量為10 μl[SYBR Premix ExTaqTM(2X)5 μl，ROX Reference Dye（50X）0.2 μl，PCR 上游引物（10 mol/L）0.4 μl，PCR 下游引物（10 mol/L）0.4 μl，稀釋的 cDNA 模板 4 μl]。同一樣品需要設置3個重復孔，點樣混勻放入Real-Time PCR儀中。按照設定好的程序進行轉錄（95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸25 s，擴增50個循環，溶解曲線分析：95 ℃ 0 s，65 ℃15 s，95 ℃ 0 s）。所得結果用Real-Time PCR儀自帶軟件Roche LightCycler480 進行分析，計算 2-ΔΔCt值，獲得關節軟骨細胞各基因的表達情況。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 關節軟骨細胞中 MMP-13、p65、p-p65蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取ICMT 3 d組、ICMT 3 d+5 ng OPG組、ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組細胞，用200 μl蛋白提取裂解液（RIPA）和 2 μl 100×PMSF 加入各孔裂解 30 min后移入EP管中，12 000 r/min離心15 min，留取上清液為軟骨細胞蛋白；用BCA定量法檢測各組蛋白濃度。根據所測的蛋白濃度，按照20 μg每組的蛋白量，計算取液量。SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，5%BSA液封閉膜后抗體孵育，洗膜，凝膠成像系統顯影成像并拍照。應用Image J軟件分析Western blot條帶灰度值。p65蛋白磷酸化后變成p-p65蛋白代表NF-κB信號通路的激活，激活后會引起細胞內MMP-13蛋白的升高。

1.9 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 關節軟骨細胞形態學觀察 顯微鏡下觀察關節軟骨細胞受到ICMT 3 d刺激后，細胞形態發生變化，呈鵝卵石樣排布，形態近似圓形的關節軟骨細胞開始出現排布散亂并呈現出偏似于梭形的形態。染色后可以發現力學刺激后關節軟骨細胞的細胞外基質出現淡染現象。在ICMT的作用下，關節軟骨細胞發生了退變，而用OPG預處理后的ICMT組細胞，這種現象得到一定程度的逆轉，見圖1（插頁）。

圖1 關節軟骨細胞形態及表型鑒定（a：對照組；b：ICMT 3 d組；c：ICMT 3 d+20 ng OPG組；倒置相差光學顯微鏡，×40；d：對照組；e：ICMT 3 d 組；f：ICMT 3 d+20 ng OPG 組；甲苯胺藍染色，×40）

2.2 各組關節軟骨細胞存活率比較 ICMT 1 d組、ICMT 2 d組、ICMT 3 d組與對照組關節軟骨細胞存活率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖2。5 ng OPG組、10 ng OPG組和20 ng OPG組與對照組關節軟骨細胞存活率比較，差異均無統計學意義（均 P＞0.05），見圖 3。

圖2 ICMT刺激下各組關節軟骨細胞存活率比較

圖3 不同濃度OPG作用下各組關節軟骨細胞存活率比較

2.3 各組關節軟骨細胞中二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9、MMP-13 mRNA表達水平比較 與對照組比較，ICMT 1 d組、ICMT 3 d組細胞中二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表達水平均下降，ICMT 3 d組細胞中MMP-13 mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 4。與 ICMT 3 d組比較，ICMT 3 d+10 ng OPG組細胞中二型膠原、SOX-9 mRNA表達水平均升高，ICMT 3 d+20 ng OPG組細胞中二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表達水平均升高，ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組細胞中MMP-13 mRNA表達水平均下降，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 5。

圖4 ICMT刺激下各組關節軟骨細胞相關基因表達變化

圖5 OPG處理下ICMT刺激關節軟骨細胞相關基因表達變化

2.4 各組關節軟骨細胞中MMP-13、p-p65蛋白表達水平比較 與ICMT 3 d組比較，ICMT 3 d+5 ng OPG 組、ICMT 3 d+10 ng OPG 組、ICMT 3 d+20 ng OPG組MMP-13蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6和表2。與ICMT 3 d組比較，ICMT 3 d+10 ng OPG組、ICMT 3 d+20 ng OPG組p-p65蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 7和表 2。

圖6 各組細胞中MMP-13蛋白表達的電泳圖

表2 各組細胞中MMP-13和p-p65蛋白表達水平比較

圖7 各組細胞中p-p65蛋白表達的電泳圖

3 討論

KOA的病因主要為關節軟骨的破壞，不恰當的力學刺激會導致關節軟骨的破壞，進而使關節軟骨無法緩解運動過程中的正常力學刺激，導致關節出現功能障礙并引起疼痛[15-16]。目前認為，不恰當的力學刺激除了對關節軟骨產生直接破壞外，其也會導致關節內的炎癥因子釋放并使關節發生慢性炎癥反應，逐步引起關節的退變[17-19]。

本研究模擬生物膝關節力學產生原理，給體外的關節軟骨細胞以0.5 Hz，8%壓強的ICMT，通過各種不同的實驗方法，證明了力學刺激在不引起軟骨細胞發生凋亡的前提下，細胞逐漸出現自然退變。本研究發現在細胞退變的過程中，NF-κB信號通路起主導作用，NF-κB信號通路激活后，通過調控表達一系列降解酶的產生，分解細胞基質中細胞賴以生存的物質，引起細胞的退變、裂解、壞死，其中MMP-13是NF-κB信號通路激活后導致細胞退變的關鍵性物質，其產生的多少與信號通路的激活程度呈正相關[20-21]。

OPG作為一種生長因子受體，在多種細胞中具有抑制NF-κB信號通路的能力[13]。目前OPG在關節軟骨細胞退變中的作用機制缺乏相關研究，本研究通過力學的作用模擬出關節軟骨細胞體外退變的過程發現，力學刺激后關節軟骨細胞中NF-κB信號通路激活，軟骨細胞發生炎癥反應和退變，MMP-13表達升高，引起細胞外基質二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9的降解，細胞形態學改變。而在細胞受到力學刺激過程中，應用合適濃度的OPG處理細胞，可觀察到NF-κB信號通路被抑制，MMP-13表達降低，關節軟骨細胞中重要物質二型膠原、蛋白聚糖、SOX-9未隨著力學刺激發生明顯降解。

綜上所述，本研究認為OPG通過調控NF-κB信號通路延緩力學刺激引起的關節軟骨細胞退變，起到保護關節軟骨和膝關節的重要作用，在治療膝關節炎和預防膝關節退變中具有廣闊的前景。