HOXB5對結直腸癌細胞有氧糖酵解和惡性增殖的影響

潘烽平 李彥 張明明

據2018年全球癌癥統計數據報告，每年因結直腸癌（colorectal cancer,CRC）死亡超過 700 000例[1]。在我國，多數CRC患者確診時已經處于進展期，對于這部分患者，目前的手術和輔助治療效果有限且不良反應較大[2-3]，患者預后欠佳[4]。因此，深入了解CRC發生及發展的分子機制至關重要。正常細胞主要依靠線粒體的氧化磷酸化供能，而腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下，依然優先通過有氧糖酵解途徑來提供能量，該現象稱為 Warburg效應[5]。研究表明，癌基因、抑癌基因在腫瘤有氧糖酵解過程中發揮重要作用[6]，例如在胰腺癌中，UHRF1通過轉錄抑制SIRT4來促進腫瘤細胞的有氧糖酵解和增殖[7]；在CRC中，B7-H3調控HK2來促進腫瘤細胞的有氧糖酵解和化療抵抗，從而影響患者的預后[8]。同源盒蛋白（homeobox protein,HOX）B5是一種新型轉錄因子，參與細胞增殖和分化的調控。相關研究表明，HOXB5參與人類多種惡性腫瘤的發生、發展過程，例如在胰腺癌中，HOXB5通過激活GSK3β/β-catenin通路來促進腫瘤細胞增殖轉移和侵襲[9]；在雌激素受體陽性的乳腺癌中，HOXB5能促進腫瘤細胞增殖和轉移[10]；在CRC中，HOXB5的高表達與患者遠處轉移、高臨床分期和預后不良呈正相關[11]。但尚無研究證明HOXB5是否能通過調節CRC細胞代謝來參與癌變過程。因此，本研究就HOXB5對CRC細胞有氧糖酵解和惡性增殖的影響作一探討，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養 人 CRC細胞株（SW480、Lovo、Caco2、HCT116）購自中國科學院上海細胞庫。將細胞株置于含10%FBS的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2的條件下培養。每1～2 d使用胰蛋白酶消化傳代1次，保持細胞活力，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 細胞選擇 內源性HOXB5蛋白表達水平在Caco2細胞中最低，在 SW480、Lovo細胞中次之，在HCT116細胞中最高，見圖1。故本實驗選擇Caco2細胞用于過表達實驗，HCT116細胞用于敲低實驗。

圖1 HOXB5在CRC細胞系中表達的電泳圖

1.3 細胞轉染 過表達HOXB5的質粒、敲低HOXB5的質粒、對照質粒均購自蘇州吉瑪公司。將細胞（3×104個/孔）均勻接種至24孔板內，待細胞生長融合度約70%時，按照Lipofectamine 2000說明書步驟將目的質粒、對照質粒轉染細胞。轉染培養48 h后，收集細胞用于實驗研究。

1.4 HOXB5對CRC細胞增殖能力影響的檢測 采用CCK-8法。將細胞（3×103個/孔）鋪在96孔板中培養，每24 h測定一次細胞活力。每次測量時加入10 μl CCK-8溶液，在培養箱中孵育2 h，然后使用分光光度計測量每個樣品波長450 nm處的吸光度（OD450）值。每組測量3孔，取平均值。

1.5 HOXB5對CRC細胞平板克隆形成能力影響的檢測 采用平板克隆實驗。將細胞（4×104個/孔）接種至6孔板中，并在含10%FBS的培養基中培養2周。甲醇固定菌落，結晶紫染色，采集圖像并計數平板克隆形成數。

1.6 HOXB5對CRC細胞有氧糖酵解影響的檢測（1）葡萄糖消耗量檢測：按照葡萄糖檢測試劑盒說明書，將細胞（3×104個/孔）接種至96孔板中，常規培養，生長過夜。第2天將培養基移除，PBS清洗3次，加入100 μl無葡萄糖的培養基（含 150 μg/ml的 2-NBDG溶液），培養適當時間。移除上清液，加入200 μl cellbased Assay Bufffer溶液，369 r/min 離心 5 min；移除上清液，加入 200 μl cell-based Assay Bufffer溶液，立即上機檢測。（2）乳酸含量檢測：按照乳酸檢測試劑盒說明書，將1×106個細胞溶于100 μl乳酸檢測緩沖液中，12 000 r/min離心10 min，移除雜質、過濾掉乳酸脫氫酶后，取10 μl加入96孔板中，加入適量乳酸檢測緩沖液調節體積至50 μl；再加入50 μl反應工作液至96孔板中充分混勻，室溫、避光孵育30 min；使用熒光分光光度計檢測。（3）ATP含量檢測：按照ATP檢測試劑盒說明書，將2×106個細胞溶于100 μl ATP檢測緩沖液中，12 000 r/min離心11 min，吸取上清液后，取11 μl加入96孔板中，加入適量ATP檢測緩沖液調節體積至52 μl。再加入50 μl反應工作液至96孔板中充分混勻，室溫、避光孵育30 min；使用熒光分光光度計檢測。

1.7 HOXB5對CRC細胞糖酵解相關蛋白影響的檢測 采用Western blot法。將細胞平鋪在6孔板中，待細胞融合度達到75%時，用 PBS洗滌細胞并用 RIPA裂解液裂解。然后將裂解物置于冰上進行超聲處理，4℃、13 000 r/min離心5 min，去除細胞碎片。經過蛋白濃度測定、蛋白變性等步驟制作蛋白樣品。將樣品在12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（30 μg/泳道）中溶解并轉移至聚偏氟乙烯膜上。在4℃下，使用適當抗體探測膜過夜。洗滌3次后，將膜置于辣根過氧化物酶標記的二抗中室溫下孵育2 h；采用增強化學發光法顯示蛋白質條帶。實驗中使用到的抗體有丙酮酸激酶同工酶 2（pyruvate kinase isoenzyme,PKM2）抗體（1∶1 000）、乳酸脫氫酶 A（lactate dehydrogenase A,LDHA）抗體（1∶1 000）、葡萄糖轉運蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT1）抗體（1∶1 000），均購自英國 Abcam 公司。

1.8 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HOXB5對CRC細胞增殖能力的影響 在Caco2細胞中，過表達HOXB5能明顯增強細胞增殖能力（P＜0.05）；在HCT116細胞中，敲低HOXB5能明顯減弱細胞增殖能力（P＜0.05），見圖 2。

圖2 HOXB5對CRC細胞增殖能力的影響（a：過表達HOXB5對Caco2細胞增殖能力的影響，*P＜0.05；b：敲低HOXB5對HCT116細胞增殖能力的影響，*P＜0.05）

2.2 HOXB5對CRC細胞平板克隆形成能力的影響在Caco2細胞中，過表達HOXB5能明顯增強細胞平板克隆形成能力（P＜0.05）；在HCT116細胞中，敲低HOXB5能明顯減弱細胞平板克隆形成能力（P＜0.05），見圖3。

圖3 HOXB5對CRC細胞平板克隆形成能力的影響（a：過表達HOXB5對Caco2細胞平板克隆形成能力的影響，*P＜0.05；b：敲低HOXB5對HCT116細胞平板克隆形成能力的影響，*P＜0.05）

2.3 HOXB5對CRC細胞有氧糖酵解的影響 在Caco2細胞中，過表達HOXB5能明顯增加細胞葡萄糖消耗量以及乳酸、ATP含量（均P＜0.05）；在HCT116細胞中，敲低HOXB5能明顯減少細胞葡萄糖消耗量以及乳酸、ATP含量（均 P＜0.05），見圖 4。

2.4 HOXB5對CRC細胞糖酵解相關蛋白的影響在Caco2細胞中，過表達HOXB5能明顯上調PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表達水平（均 P＜0.05）；在 HCT116細胞中，敲低 HOXB5能明顯下調 PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表達水平（均P＜0.05），見圖5。

圖5 過表達或敲低HOXB5后CRC細胞糖酵解相關蛋白表達的電泳圖

3 結論

在惡性腫瘤的發展過程中，整個代謝網絡在癌基因、抑癌基因主導下發生“重編程”，而營養物質在代謝網絡中的流向和流量被重新定義。相較于正常細胞，癌細胞內葡萄糖攝取和糖酵解速率明顯增加，高速糖酵解能快速產生ATP，不再偶聯線粒體氧化代謝，產生的丙酮酸大多數由乳酸脫氫酶催化，在細胞質基質中轉化為乳酸。即使在氧氣充足支持氧化磷酸化的情況下，惡性腫瘤細胞仍青睞糖酵解作為主要產能途徑，這種糖代謝的“重編程”是癌細胞的一個顯著特征，該現象被稱為 Warburg效應或有氧糖酵解[12]。體內外實驗證實，有氧糖酵解對于多種惡性腫瘤細胞的增殖至關重要，可能是聯系惡性腫瘤細胞能量代謝與促增殖表型的一個普遍機制[13]。

越來越多研究表明，HOX家族在人類惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用，且參與腫瘤細胞異常代謝的過程。研究表明，HOXC9調節鼻咽癌細胞糖酵解過程，并促進腫瘤的進展[14]。此外，也有研究證實HOXB5參與胰腺癌[15]、頭頸部鱗癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18]、胃癌[19]等多種腫瘤的癌變過程。在CRC中，HOXB5高表達是患者腫瘤復發和預后的一個獨立危險因素。在機制方面，HOXB5過表達可通過反式激活CXCR4、ITGB3來促進CRC轉移[11]。然而，目前尚無研究探討并明確HOXB5能否通過調節CRC有氧糖酵解過程來參與癌變過程。本研究結果顯示，過表達HOXB5可以明顯增強Caco2細胞增殖及平板克隆形成能力，增加Caco2細胞葡萄糖消耗量以及糖酵解產物乳酸和ATP含量，上調糖酵解相關蛋白PKM2、LDHA和GLUT1蛋白表達水平；而敲低HOXB5可以明顯減弱HCT116細胞增殖及平板克隆形成能力，減少HCT116細胞葡萄糖消耗量以及糖酵解產物乳酸、ATP含量，下調糖酵解相關蛋白PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表達水平。

綜上所述，本研究證實HOXB5通過促進CRC細胞有氧糖酵解來增強其惡性增殖。但關于HOXB5調控有氧糖酵解的具體分子機制有待進一步研究明確。