甲狀腺激素受體相互作用因子13在B細胞淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義

錢新月 陳麗花 周泉 沈文艷 莫娟芬 王宙政 韓艷霞 張東凱 張斌忠 胡蓓莉

B細胞淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤的一種，其異質性很強，療效差別很大。甲狀腺激素受體相互作用因子 13（thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13）是一種AAA-ATP酶，在有絲分裂和減數分裂過程中發揮重要作用[1]。腫瘤的發生往往從DNA損傷開始，TRIP13可重塑希爾丁復合物——一種DNA損傷修復相關的重要物質，從而干擾損傷DNA的修復，導致腫瘤的發生[2]。目前已有研究發現，TRIP13不但與肺癌、膠質瘤、腎癌的發病有關[3-4]，而且在惰性B細胞淋巴瘤中也有表達[5]。因此，本研究探討TRIP13在B細胞淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年9月至2020年11月在嘉興市第二醫院就診后進行淋巴結活檢，并留取多余的新鮮淋巴結活檢組織凍存的B細胞淋巴瘤患者44例為研究對象，其中男23例，女21例；年齡44～83（66.09±9.64）歲。所有患者病理學診斷結果均為B細胞淋巴瘤。所有患者活檢前均未接受任何化療、放療或生物學治療；經病理確診后按照臨床指南規范診治，接受標準化療至少2個療程。參照2016年WHO對B細胞淋巴瘤分型診斷標準，將44例患者分為惰性淋巴瘤組（包括3a級及以下的濾泡淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、小B細胞淋巴瘤、惰性套細胞淋巴瘤）20例和侵襲性淋巴瘤組（包括3b級濾泡淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤、經典型套細胞淋巴瘤、高級別B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤）24例。本研究經嘉興市第二醫院醫學倫理委員會審查通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 Trizol試劑購自美國Sigma公司；PrimeScriptRTMaster Mix逆轉錄試劑、SYBR Fast qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司；TRIP13 antibody試劑購自美國GeneTex公司；二抗山羊抗兔IgG（H+L）、HRP試劑均購自北京康為世紀生物科技有限公司；NanoDrop分光光度儀購自美國Thermo Scientific公司；ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；Axio LabA1顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.3 TRIP13 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。使用Trizol試劑提取淋巴結活檢組織RNA，并使用NanoDrop分光光度儀檢測RNA濃度。按照Prime－ScriptRTMaster Mix逆轉錄試劑盒說明書所述方法，在冰上配制10 μl的逆轉錄反應液，37℃ 15 min，85℃5 s，4℃結束反應。反應結束后按照SYBR Fast qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒說明在冰上配制20 μl反應體系。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內參，引物序列由上海生工科技生物公司合成。GAPDH上游引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，下游引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；TRIP13 上游引物：5'-TGCAGCAAATCACTGGGTTCT-3'， 下 游 引 物 ：5'-GGTTCCAGGTGATGAGGTTGC-3'。將逆轉錄反應液與反應體系輕輕混勻后放置在ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀上。PCR擴增標準程序：95℃預變性30 s；PCR反應：95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環。反應結束確認熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達量。

1.4 TRIP13蛋白表達檢測 采用En Vison免疫組化染色法。淋巴瘤組織石蠟切片脫蠟至水。3%過氧化氫室溫孵育消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3遍后PBS浸泡，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育后棄血清。滴加一抗工作液，4℃過夜。洗滌，滴加二抗，37℃孵育30 min。洗滌，滴加適量辣根酶，37℃孵育30 min。洗滌，滴加顯色劑顯色。在Axio LabA1顯微鏡下，每張切片隨機選取至少4個不同高倍視野（×400），每個視野計數200個腫瘤細胞。陽性細胞的胞質或胞核著色，淡黃色為弱染色，棕黃色為中度染色，棕褐色為強染色。無染色為0，＜25%的腫瘤細胞呈弱染色為1+，25%～50%的腫瘤細胞呈中度染色為2+，＞50%～100%的腫瘤細胞呈強染色為3+。根據TRIP13免疫組化表達情況，將B細胞淋巴瘤患者分為TRIP13陰性組（0）和TRIP13陽性組（≥1+），比較兩組患者的臨床特征；再根據TRIP13免疫組化表達強度，將TRIP13陽性患者分為TRIP13弱陽性組（1+）和TRIP13強陽性組（≥2+），比較兩組患者的臨床特征。

1.5 臨床資料收集 收集所有患者性別、年齡、B細胞淋巴瘤分型情況、增殖指數（Ki-67）、乳酸脫氫酶、β2微球蛋白、白蛋白水平、外周血淋巴細胞計數、外周血淋巴細胞亞群指標包括T淋巴細胞比例、T輔助細胞比例、T抑制細胞比例、B細胞比例、NK細胞比例、活化CD4+細胞比例、活化CD8+細胞比例及CD4+/CD8+。按照《美國國立綜合癌癥網絡B細胞淋巴瘤治療指南》規范治療2個療程后采用Lugarno評估標準評估療效[6]，統計2個療程達完全緩解（complete response,CR）及未達CR的例數。

1.6 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 惰性淋巴瘤組和侵襲性淋巴瘤組TRIP13 mRNA表達水平比較 惰性淋巴瘤組和侵襲性淋巴瘤組TRIP13 mRNA表達水平分別為0.37（0.17，1.36）和0.69（0.28，1.15），兩組比較差異無統計學意義（Z=-0.141，P＞0.05）。

2.2 B細胞淋巴瘤患者TRIP13蛋白表達情況分析免疫組化染色顯示，TRIP13可表達于淋巴瘤細胞的細胞核中，也可表達于淋巴瘤細胞的胞質中。根據TRIP13 免疫組化表達情況，分為 0、1+、2+、3+四個等級，見圖1（插頁）。TRIP13免疫組化為0者12例，1+者20例，2+者9例，3+者3例。

2.3 不同TRIP13免疫組化表達強度B細胞淋巴瘤患者的臨床特征比較

2.3.1 TRIP13陰性組和TRIP13陽性組患者臨床特征比較 44例B細胞淋巴瘤患者中，TRIP13陰性組12例，TRIP13陽性組 32例。TRIP13陽性組患者TRIP13 mRNA表達水平、Ki-67水平及活化CD8+細胞比例均高于TRIP13陰性組，T輔助細胞比例、活化CD4+細胞比例、CD4+/CD8+均低于TRIP13陰性組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而兩組患者性別、年齡、B細胞淋巴瘤分型、乳酸脫氫酶水平、β2微球蛋白水平、白蛋白水平、外周血淋巴細胞計數、T淋巴細胞比例、T抑制細胞比例、B細胞比例、NK細胞比例、2個療程達CR例數比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 TRIP13陰性組和TRIP13陽性組患者臨床特征比較

2.3.2 TRIP13弱陽性組和TRIP13強陽性組患者臨床特征比較 32例TRIP13陽性患者中，TRIP13弱陽性組20例，TRIP13強陽性組12例。TRIP13弱陽性組患者TRIP13 mRNA表達水平、Ki-67水平、活化CD8+細胞比例均低于TRIP13強陽性組，活化CD4+細胞比例、CD4+/CD8+均高于TRIP13強陽性組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而兩組患者性別、年齡、B細胞淋巴瘤分型、乳酸脫氫酶水平、β2微球蛋白水平、白蛋白水平、外周血淋巴細胞計數、T淋巴細胞比例、T輔助細胞比例、T抑制細胞比例、B細胞比例、NK細胞比例、2個療程達CR例數比較差異均無統計學意義（均 P＞0.05），見表 2。

表2 TRIP13弱陽性組和TRIP13強陽性組患者臨床特征比較

3 討論

TRIP13作為一種新型的有絲分裂檢查點沉默蛋白，是一種AAA-ATP酶。它與亞基閉合型有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（closed mitotic arrest deficiency protein 2,c-Mad2）結合能夠導致有絲分裂檢查點復合物（mitotic checkpoint complex,MCC）的失活，從而導致姐妹染色單體錯誤分離[7]。

本研究結果顯示，免疫組化TRIP13陰性組和陽性組之間、TRIP13弱陽性組和強陽性組患者之間TRIP13 mRNA表達水平比較差異均有統計學意義，提示免疫組化法測定TRIP13在淋巴瘤組織中的表達情況與使用RT-PCR方法檢測組織中TRIP13的mRNA水平具有較好的一致性，免疫組化法測定TIRP13的表達情況一定程度上可以反映其組織中的基因水平。在臨床特征上，本研究結果顯示，TRIP13陽性組和陰性組相比、TRIP13強陽性組與弱陽性組相比，具有更高的Ki-67水平，提示TRIP13的表達與B細胞淋巴瘤的癌細胞具有更高增殖速度存在一定的內在聯系。這和實體瘤的研究結果一致，即染色體不穩定是癌細胞產生的遺傳學機制，TRIP13過表達觸發有絲分裂檢查點過早的沉默可能促進癌癥發展及腫瘤細胞的增殖[8]。這一點已在很多實體瘤中被證實[9-12]。在血液系統腫瘤中，TRIP13是高危多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）中過度表達的 70個基因之一[13]，也是構成 MM染色體不穩定性特征的10個基因之一[14]。研究發現，在T細胞淋巴瘤中，蕈樣真菌病腫瘤組織中TIRP13表達水平高于對照組[15]。

本研究還發現，TRIP13的免疫組化情況和淋巴細胞亞群有關。TRIP13陽性組和陰性組相比、TRIP13強陽性組與弱陽性組相比，活化CD4+細胞比例更低，活化CD8+細胞比例更高。以往研究發現，CD4+T淋巴細胞數越低，CD8+T淋巴細胞數越高，分期越晚，預后越差[16]。提示細胞免疫與B細胞淋巴瘤的進展有一定相關性。研究發現，與健康人群相比，彌漫大B細胞淋巴瘤患者外周血淋巴細胞亞群具有更低的CD4+T細胞比例和更高的CD8+T細胞比例[17]?？赡芎土馨土龅陌l生過程中，淋巴細胞亞群發生應激性變化有關。本研究發現，TRIP13表達強度不但與淋巴瘤細胞Ki-67水平有關，而且與T淋巴細胞亞群的應激性反應程度有關。TRIP13陽性組和陰性組相比、TRIP13強陽性組與弱陽性組相比，T細胞免疫應激情況更紊亂。研究發現在MM中，CD4+細胞比例、CD4+/CD8+下降，也提示存在免疫紊亂[18]，和本研究結果相符。但在膠質瘤中，與低 TRIP13水平腫瘤組織相比，高TRIP13水平腫瘤組織CD8+T細胞特異性基因與調節性 T細胞特異性基因mRNA水平降低[19]，似乎和本研究不符。這可能與膠質瘤和淋巴瘤在腫瘤發生、發展中細胞免疫反應存在一定差異有關。

本研究還發現TRIP13陰性組和TRIP13陽性組、TRIP13弱陽性組和TRIP13強陽性組患者2個療程達CR例數比較差異均無統計學意義。雖然有研究表明TRIP13可激活Akt信號通路，導致包括MAD在內的蛋白質的泛素化、磷酸化和降解，從而導致腫瘤的化學抗藥性[20]，但本研究結果并未反映這一點，考慮可能與樣本量較小有關。

綜上所述，本研究采用免疫組化法分析B細胞淋巴瘤組織中TRIP13蛋白表達情況，發現TRIP13蛋白表達水平與mRNA水平一致，且TRIP13陽性及強陽性與更高的Ki-67水平、活化CD8+細胞比例及更低的活化CD4+細胞比例有關。提示TRIP13陽性可能和腫瘤細胞增殖及免疫調控異常等發病機制有關。