PDLIM2對前列腺癌預后影響的生物信息學分析

樸松哲 鄭蘭 王鑫 何浩輝 柯莽

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是男性常見的惡性腫瘤之一。據2021年全球統計數據報告，PCa發病率居男性惡性腫瘤的第一位[1]。盡管PCa早期患者的治愈率有所提高，但轉移或復發PCa，特別是去勢抵抗性 PCa（castration resistant prostate cancer,CRPC）患者的預后仍較差。目前，免疫療法在癌癥治療中被廣泛應用。研究發現，PCa的腫瘤微環境表現為免疫抑制，因此免疫療法在轉移性PCa中的臨床獲益有限[2]。除派姆單抗被美國FDA批準用于高微衛星不穩定性（microsatellite instability,MSI）和高腫瘤突變負荷（tumor mutation burden,TMB）晚期實體腫瘤治療外，Sipuleucel-T療法仍是美國FDA批準的唯一用于轉移性PCa的免疫療法。因此，探索一種能預測腫瘤免疫治療反應性的生物標志物和新的免疫治療靶點是該領域的研究熱點。PDLIM2基因位于人8號染色體（8p21.2）上，是輔肌動蛋白相關LIM蛋白超家族成員之一，參與細胞增殖、細胞遷移、細胞極化、細胞間連接的調節以及上皮間質轉化、免疫細胞識別等過程[3]。近來研究發現，PDLIM2參與免疫調節過程，在腫瘤發生、發展過程中起重要作用[4]。相關研究報道，下調PDLIM2表達能明顯抑制CRPC樣癌細胞生長和侵襲能力[4-6]。然而，目前關于PDLIM2在PCa中的表達及其與臨床病理特征、預后的關系尚不清楚。因此，本文利用生物信息學技術分析PDLIM2對PCa預后的影響，并深度挖掘其基因功能，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 數據獲取 利用UCSC Xena數據庫（http://www.xebabrowser.net）下載癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）PCa的3級RNA序列數據、突變數據、臨床病理參數和生存期數據。

1.2 表達差異分析 利用R軟件（V4.0.3）limma、ggplot2程序包分析PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達水平的差異。

1.3 表達驗證 利用UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/）中的TCGA模塊比較PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達水平及其啟動子區域甲基化水平，并進一步根據患者Gleason評分、分子亞型進行分層分析。TCGA將PCa分為7個分子亞型，包括ERG融合、ETV1融合、ETV4融合、FLI1融合、SPOP突變、FOXA1突變、IDH1突變。利用HPA數據庫（https://www.proteinatlas.org）比較不同級別PCa組織中PDLIM2蛋白表達水平的差異，分析PDLIM2在細胞內的定位。

1.4 生存分析 對TCGA的PCa RNA-seq數據進行單因素Cox回歸分析，比較PDLIM高、低表達（以PDLIM2 mRNA表達水平的中位數為界值）組患者總生存期（overall survival,OS）和無進展生存期（progression free survival,PFS）。

1.5 PDLIM2共表達基因富集分析 使用Linked Omics數據庫（http://www.linkedomics.org/login.php）的 Link Finder模塊分析PCa隊列（479例）中與PDLIM2相關的差異表達基因，采用Spearman秩相關分析方法。使用Linked Omics數據庫的Link Interpreter模塊對差異表達基因進行通路和網絡分析，采用基因本體富集分析法。

1.6 PDLIM2與腫瘤免疫細胞浸潤程度、TMB、MSI、免疫檢查點（immune checkpoint，ICP）基因表達及腫瘤干性評分的相關性分析 利用Sanger Box數據庫查詢“PDLIM2”，采用TIMER算法分析PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平。利用基因模塊分析PDLIM2 mRNA表達水平與腫瘤免疫細胞（包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞）浸潤程度、TMB、MSI、ICP基因表達及腫瘤干性評分之間的相關性，采用Pearson相關分析法。

2 結果

2.1 PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達水平的差異 利用TCGA數據分析發現，PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平明顯低于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 PDLIM2表達驗證和相關分析 利用UCLCAN數據庫驗證發現，與癌旁正常組織相比，PCa組織中PDLIM2 mRNA 表達水平較低（P＜0.05），見圖 1a（插頁）；而PDLIM2啟動子區域甲基化水平較高（P＜0.05），見圖1b（插頁）?；赥CGA數據庫分析PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平與Gleason評分、分子分型的關系，結果顯示Gleason評分9分者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平明顯高于6、7分者（均 P＜0.05），見圖1c（插頁）；與癌旁正常組織比較，ERG融合、ETV1融合、SPOP突變者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平均明顯下調（均P＜0.05），其中SPOP突變者較ERG融合者PDLIM2 mRNA表達水平明顯上調（P＜0.05），見圖1d（插頁）。HPA數據庫分析發現細胞中PDLIM2主要定位于細胞肌動蛋白絲，黏附位點，見圖1e（插頁）。免疫組化結果顯示，隨PCa組織級別的升高，PDLIM2的染色強度明顯增強，見圖1f（插頁）。

圖1 PDLIM2表達水平與PCa患者不同臨床病理學參數的關系和細胞定位結果（a：PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達水平比較；b：PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2啟動子區域甲基化水平比較；c：不同Gleason評分患者PCa組織中PDLIM2mRNA表達水平比較；d：不同分子亞型患者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平比較；e：PDLIM2細胞定位；f：不同級別PCa組織中PDLIM2蛋白表達的免疫組化染色所見）

2.3 生存分析 利用TCGA數據分析發現，在PCa患者中，PDLIM2高表達者PFS明顯短于PDLIM2低表達者，差異有統計學意義（P＜0.05）；而 PDLIM2高、低表達者OS比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 PDLIM2共表達基因富集分析 使用Linked Omics的功能模塊分析479例PCa患者在TCGA中的mRNA測序數據，結果顯示PDLIM2與12 198個基因呈正相關，與7 852個基因呈負相關，見圖2a（插頁）；熱圖分析顯示，PDLIM2 mRNA表達與TSPAN4、LGALS1、GAS6、GYPC、LYL1 基因均呈正相關（rs=0.76、0.74、0.73、0.73、0.73，均 P＜0.05），與 SMARCC1、HOOK1、ZNF24、DNAJC16、FOXA1基因均呈負相關（rs=-0.65、-0.62、-0.62、-0.61、-0.61，均 P＜0.05），見圖 2b-c（插頁）。與PDLIM2相關的基因主要富集在膠原代謝過程、整合素介導的信號通路、體液免疫反應、白細胞遷移、IFN-γ產生、血管生成、急性炎癥反應等生物學過程。

圖2 PDLIM2共表達基因富集分析結果（a：火山圖，綠色所示為下調基因，紅色所示為上調基因；b：與PDLIM2呈負相關的前50個基因的熱圖；c：與PDLIM2呈正相關的前50個基因的熱圖）

2.5 PDLIM2與腫瘤免疫細胞浸潤程度、TMB、MSI、ICP基因表達及腫瘤干性評分的相關性 PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞浸潤程度均呈正相關（r=0.24、0.39、0.12、0.29、0.49、0.44，均 P＜0.05）；與 TMB、MSI均呈正相關（均 r＞0，均 P＜0.05）；與 38個 ICP基因表達均呈正相關（均 r＞0，P＜0.05）；與腫瘤干性評分呈正相關（r=0.16，P＜0.05）。

3 討論

目前關于PDLIM2在腫瘤中的作用仍存在爭議。有文獻報道PDLIM2能夠調節乳腺上皮細胞極性，是抑制乳腺癌發生、發展的關鍵機制[7]。體外和體內實驗證實，上調PDLIM2表達可抑制乳腺癌細胞非錨定生長[8]。Sun等[9]報道了PDLIM2在肺癌中受表觀遺傳抑制，并與程序性死亡受體1抑制劑治療的耐藥性和不良預后有關。而維生素D可直接上調PDLIM2表達，從而誘導乳腺浸潤癌細胞中PDLIM2啟動子區域的去甲基化[10]。以上結果均提示PDLIM2具有抑癌作用。然而，在雄激素非依賴性PCa細胞株DU145中PDLIM2表達明顯上調，而抑制PDLIM2表達可抑制腫瘤細胞侵襲能力。此外，雄激素敏感的PCa細胞與CRPC樣癌細胞中的PDLIM2表達水平存在明顯差異。在雄激素敏感的PCa細胞中，PDLIM2過表達能抑制腫瘤細胞的增殖能力；在CRPC樣癌細胞中，PDLIM2高表達能促進細胞增殖、惡性轉化和上皮間質轉化過程[7]。以上研究結果說明PDLIM2同時具有促癌和抑癌作用，其作用可能與腫瘤類型和細胞環境等因素有關。此外，PDLIM2可能是PCa潛在的治療靶點。

本研究利用TCGA數據分析顯示，PDLIM2在PCa組織中呈低表達，且PCa組織中PDLIM2啟動子區域甲基化水平高于癌旁正常組織；生存分析結果顯示，PDLIM2高表達的PCa患者PFS更短。Song等[11]報道PDLIM2啟動子甲基化可下調PDLIM2 mRNA表達水平，與本研究結果一致。本研究結果發現，PDLIM2 mRNA表達水平隨Gleason評分增高而升高，與Gleason 6、7分患者比較，Gleason 9分患者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平明顯較高。HPA數據庫的免疫組化分析結果顯示，PDLIM2主要定位于細胞肌動蛋白絲，黏附位點；且隨著PCa組織級別的升高，PDLIM2蛋白染色強度明顯增強。這說明PDLIM2 mRNA表達水平與PCa組織分級有關，可能參與PCa發生、發展過程。本研究還分析了PCa中與PDLIM2共表達基因的生物學功能，結果顯示PDLIM2共表達基因主要富集在膠原代謝過程、整合素介導的信號通路、體液免疫反應、白細胞遷移、IFN-γ產生、血管生成、急性炎癥反應等生物學過程。研究發現，PDLIM2作為腫瘤抑制因子，通過抑制腫瘤相關基因，增加參與抗原呈遞和T細胞啟動，說明PDLIM2在PCa中可能參與免疫微環境調節[12]。

TIMER數據庫結果顯示，PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等免疫細胞浸潤程度均呈正相關。從理論上分析，具有高TMB、MSI的腫瘤患者對ICP抑制劑具有更高的敏感性。此外，ICP基因的高表達被廣泛作為免疫治療反應的預測因子。本研究發現，PCa組織中PDLIM2 mRNA表達水平與TMB、MSI和ICP基因表達均呈正相關，說明PDLIM2可能是腫瘤免疫治療效果的潛在預測因子。2021年美國國家綜合癌癥網絡指南在M1期CRPC全身治療中考慮新增TMB檢測，并提出帕博麗珠單抗用于高MSI或錯配修復缺陷（different mismatch repair,dMMR）或TMB≥10 mut/Mb的M1期CRPC患者。但目前關于TMB在PCa免疫治療中的預測價值結果并不一致，可能與TMB算法不同有關[13]。Abida等[14]發現在1 033例轉移性CRPC患者中，有32例表現為高MSI，其中11例接受基于ICP抑制劑的治療，近半數患者前列腺特異抗原水平下降幅度＞50%。Schweizer等[15]基于小樣本研究發現，10例PCa導管內癌患者中有4例為dMMR，其中3例患者具有高MSI特征；值得注意的是，其中1例dMMR/高MSI患者在使用派姆單抗治療期間，前列腺特異抗原水平明顯降低。以上結果說明PDLIM2高表達的PCa患者可能對免疫療法更加敏感，可能從免疫治療中獲益，但仍需作進一步研究證實。此外，PCa組織中PDLIM2表達水平與腫瘤干性評分呈正相關，說明PDLIM2可能促進PCa腫瘤干性特征的表達，促進腫瘤發展。Dai等[16]研究發現，PCa的TME與其干細胞性呈負相關。Miranda等[17]研究發現，腫瘤細胞干細胞可影響TME的免疫應答，從而導致腫瘤異質性。以上結果提示在PCa中，PDLIM2可能通過免疫調節來影響腫瘤細胞干性。

綜上所述，PDLIM2可能成為評估PCa預后的生物標志物和腫瘤免疫治療的新靶點。但本研究結果是基于生物信息學技術分析的，仍需進一步動物實驗和臨床試驗進行驗證。