青藤堿對IL-1β誘導大鼠滑膜細胞株RSC-364增殖及炎癥因子的影響

秦玉雪，郭美珠

(上海市寶山區中西醫結合醫院，上海 201999)

青藤堿(sinomenine,SIN)是防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb)Rehd.et Wils.的主要提取物，作為傳統草藥，青藤在我國歷代本草和藥典中均有收載，始載于宋代《圖經本草》，為眾人所知。其主治疾病有風寒濕熱等外邪侵襲所致的風濕痹痛、經絡不通及小便不利等。多項研究顯示，目前已存在多種中藥制劑如正清風痛寧、鹽酸青藤堿及毛青藤等，含有青藤堿，此類復方制劑在治療免疫系統、心血管及腫瘤等方面均有可觀的效果，在治療關節炎性疾病時效果更顯著，逐漸成為治療該類疾病的首選藥物。現代藥理學研究表明，青藤堿主要具有抗炎鎮痛[1]、抑制炎癥因子分泌和表達、免疫抑制[2]、鎮痛[3]及免疫調節作用，具有毒性溫和、不成癮的優點[4]。近年來因青藤堿獨特的免疫調節特性而受到海內外研究者的重視。類風濕關節炎和強直性脊柱炎主要特征為炎癥細胞浸潤、滑膜增生以及軟骨受損最終導致骨侵蝕及骨破壞[5-6]。本實驗通過觀察青藤堿不同濃度對大鼠滑膜細胞株IL-1β誘導下RSC-364增殖率的影響，以及觀察細胞上液中炎癥因子IL-6、MMP的表達變化，為青藤堿治療炎癥性相關疾病、抗炎藥物機制的研究奠定了理論基礎，為中醫藥臨床應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠滑膜細胞株RSC-364 (北京北納創聯生物技術研究院)；青藤堿(上海源葉生物科技有限公司)；Rat IL-1β(R&D Systems公司)；胎牛血清、DMEM培養基(Sigma公司美國)；Cell CountingKit-8檢測試劑盒(碧云天生物公司)；IL-6、MMP-3 ELISA(酶聯免疫吸附測定)；試劑盒(Multisciences 聯科生物)。

1.2 儀器

酶標儀Thermo Multiskan MK3(Thermo fisher公司)；XTL-47細胞洗滌離心機(上海市離心機械研究所)；Thermo-37型CO2培養箱(Forma，美國)；Olympus—CK2相關顯微鏡(Olympus，日本)；LXJ-IIB水平離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.3 細胞培養及分組

細胞RSC-364置于細胞培養基DMEM內，培養至對數生長期，用0.25%的胰酶消化細胞，用培養基重懸細胞沉淀，調整細胞密度為2×104個/mL。向96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，37 ℃培養至細胞貼壁后，給予不同劑量的青藤堿和IL-1β，分組如下：青藤堿不同濃度(0、80、160、240、320 mg/L)組，青藤堿不同濃度+IL-1β組，1 h后再加入10 ng/mL的IL-1β；48 h后每孔加入10 μL Cell CountingKit-8，37 ℃孵育1 h后在酶聯免疫檢測儀上450 nm處測定吸光度。每組實驗數據均進行3次重復實驗，計算出平均值。

1.4 不同劑量青藤堿對大鼠滑膜細胞RSC-364增殖的IC50檢測

1.5 血清IL-6及MMP-3測定

以上細胞上清液，-70 ℃保存，采用ELISA法試劑盒檢測IL-6、MMP3的水平。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度青藤堿對大鼠滑膜細胞株RSC-364增殖率的影響

由圖1可見，分別給予青藤堿0、80、160、240、320 mg/L，48 h后，大鼠滑膜細胞株RSC-364增殖率與青藤堿組0 mg/L相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。隨著青藤堿濃度增加，細胞增殖率逐漸降低(P<0.05)，見表1。

注:A.青藤堿0 mg/L；B.青藤堿80 mg/L；C.青藤堿160 mg/L；D.青藤堿240 mg/L；E.青藤堿320 mg/L。圖1 各組大鼠滑膜細胞株RSC-364增殖情況(×10)

2.2 IL-1β誘導下的不同濃度青藤堿對大鼠滑膜細胞株RSC-364的增殖情況

不同濃度青藤堿組(0、80、160、240、320 mg/L)與IL-1β誘導下青藤堿組(0、80、160、240、320 mg/L)作用48 h后相比，青藤堿濃度越高，細胞增殖率較前明顯減少(P<0.05),由此可見，IL-1β可促進細胞增殖有效,見表1、圖2。

表1 各組對大鼠滑膜細胞株RSC-364細胞增殖情況影響

注:A.青藤堿0 mg/L+IL-1β；B.青藤堿80 mg/L+IL-1β；C.青藤堿160 mg/L+IL-1β；D.青藤堿240 mg/L+IL-1β；E.青藤堿320 mg/L+IL-1β。圖2 IL-1β誘導下的各組大鼠滑膜細胞株RSC-364細胞增殖情況(×10)

2.3 青藤堿對于大鼠滑膜細胞RSC-364的半數致死濃度IC50的測定

大鼠滑膜細胞RSC-364給予不用劑量青藤堿，進行細胞增殖實驗，結果發現隨著青藤堿濃度的增加，細胞增殖率降低，并獲得藥物對于細胞RSC-364的IC50為139.8 mg/L，見表2。

表2 各組不同濃度青藤堿對大鼠滑膜細胞RSC-364增殖率

2.4 不同濃度青藤堿對IL-1β誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364炎性因子IL-6的影響

由表3可見，青藤堿不同濃度組、青藤堿不同濃度+IL-1β組對IL-6分泌水平均呈顯著的抑制趨勢(P<0.05)。

表3 不同濃度青藤堿對IL-1β誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364炎癥因子IL-6的影響

2.5 不同濃度青藤堿對IL-1β誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364分泌MMP-3的影響

由表4可見，青藤堿不同濃度組、青藤堿不同濃度+IL-1β組對MMP-3分泌水平呈顯著的抑制趨勢(P<0.05)。

表4 不同濃度青藤堿對IL-1β誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364分泌MMP-3的影響

3 討論

類風濕關節炎和強直性脊柱炎是常見的、嚴重的慢性炎癥性自身免疫系統疾病，在中醫的辨證論治理論體系中都歸屬為“痹癥”，在風濕免疫病體系中，早期的醫家并未將強直性脊柱炎作為一種獨立的疾病進行認識，而是將其作為類風濕關節炎的一種特殊類型，為類風濕關節炎的“中樞型”或者“類風濕脊柱炎”，共同的特點為病勢遷延難愈。滑膜細胞的增殖、多種炎性細胞浸潤最終導致軟骨和骨骼的破壞是類風濕關節炎和強直性脊柱炎主要的病理表現[7-8]。在病理情況下，活化狀態下的炎性細胞可分泌促炎介質并且激活滑膜成纖維樣細胞，被激活的滑膜成纖維樣細胞可以產生促炎細胞因子和趨化因子進一步促進炎性細胞激活、分化及關節滑膜的改變，是導致關節變形和破壞最主要的病理改變之一[9]。在炎癥關節炎發病的過程中，炎性因子IL-1、腫瘤壞死因子-α及IL-6等在疾病活動中地位尤為主要。類風濕關節炎和強直性脊柱炎免疫過程中細胞因子起到直接參與作用，對促進滑膜炎癥，特別是后期的軟骨的破壞等方面均有很大的作用[10]。在類風濕關節炎和強直性脊柱炎的發病過程中炎性細胞因子IL-1β是關鍵的參與者，在其中起到重要作用，也是在IL-1成員中是最主要的炎癥因子，同時也是一種高度炎性的細胞因子，可以介導自身炎癥性疾病[11]。在滑膜炎癥與骨和軟骨的破壞過程中IL-1β和腫瘤壞死因子-α在關節滑膜細胞中的分泌顯著增多，大量的促炎介質、趨化因子以及前列腺素等釋放，造成關節滑膜炎癥的發生，引起滑膜細胞大量增殖，最終導致骨的破壞[12]。研究證實，關節炎及骨質破壞的嚴重程度與滑膜生成的IL-1β的含量有直接相關性。深入機理研究表明[13]，青藤堿的抗關節炎作用可能與其對滑膜成纖維細胞的抗增殖作用以及對關節組織的保護作用密切相關。在本次實驗的研究過程中，通過在細胞因子IL-1β誘導下大鼠滑膜細胞株RSC-364增殖建立了滑膜細胞炎癥產生的體外模型,分析青藤堿在不同濃度的情況下大鼠滑膜細胞株RSC-364在 IL-1β誘導下的增殖情況。實驗發現，青藤堿在不同濃度的情況下對大鼠滑膜細胞在細胞因子IL-1β的誘導下增殖作用顯著受到抑制,減少了滑膜的炎性浸潤。在實驗的觀察過程中,細胞因子活性和炎癥介質的含量具有明顯的劑量依賴性。本研究為更深入地闡釋青藤堿作用機制以及更好地擴大藥物臨床應用提供了理論依據。

因此，在類風濕關節炎和強直性脊柱炎的治療過程中，有效的控制病變中滑膜細胞的過度增生是需要解決的重要環節。張群燕等[14]研究表明青藤堿在滑膜細胞增殖、凋亡方面有良好的作用。許多實驗表明青藤堿在治療強直性脊柱炎方面具有良好的作用[15-16]。在風濕病的發病過程中，關節局部炎癥細胞的浸潤及炎性細胞因子大量產生是引起風濕病炎癥反應的重要因素。抑制炎癥介質的產生，對迅速緩解風濕病患者出現的各種疼痛和腫脹非常重要。青藤堿是我國傳統中藥提取物之一，在中醫藥治療中承擔了重要的角色，因此具有較好的實驗及臨床開發價值。研究中發現青藤堿可通過平衡炎癥細胞因子、干預免疫反應通道、神經保護、抗血管生成、調控基因表達及影響重要信號通路等機制起到治療效果[17],可以有效地控制AS和RA臨床癥狀。有文獻表明對類風濕關節炎纖維樣滑膜細胞運用中藥抑制有良好的作用，且在減少滑膜增生方面尤甚[18]。在近些年的相關研究中，對炎癥因子進行多項相關疾病所產生的重要作用均被證實，其中細胞因子的靶向治療具有很好的療效，而且在疾病的預后方面有更多的改善。

在類風濕關節炎和強直性脊柱炎疾病發展過程中病變主要部位發生外周及在中軸的關節，有相關研究發現,當受累的關節發生炎性改變時，滑膜細胞的過度增殖以及炎性細胞因子的出現，是導致患者關節骨質被炎癥破壞的重要要素。與上述的IL-1β在強直性脊柱炎和類風濕關節炎發病中相似的作用，IL-6也是參與其中起到關鍵性作用細胞因子之一，在參與滑膜炎癥，以及疾病后期軟骨的破壞及骨吸收起到主要的作用。血清、關節液中IL-6濃度的高低變化在類風濕關節炎和強直性脊柱炎的病情活動和進展具有顯著的關聯性。根據研究表明[19]IL-6的濃度水平不同對其產生的作用存在差異，在低濃度水平下表現為免疫調節的作用，在高濃度水平時則開始對關節產生了病理性的損傷。研究表明IL-6在強直性脊柱炎的疾病發生發展過程中起到了重要的作用[20]。肖敬等[21]進行的實驗闡述了青風藤能夠有效地減低大鼠滑膜組織中IL-6 的含量，可以顯著地控制炎癥介質的浸潤,起到保護骨關節的作用，延緩了疾病過程中骨質的破壞。鄭潔等[22]表明高劑量的青藤堿可顯著降低關節液中IL-6,表明青藤堿抑制滑膜炎，保護關節軟骨與量的高低有關。顯然在類風濕關節炎和強直性脊柱炎的病變過程中對滑膜細胞的炎癥因子IL-6的控制起到中重要的作用。本實驗選用青藤堿在不同濃度的情況下大鼠滑膜細胞株在10 ng/mL的IL-1β誘導下分析RSC-364的增殖及對產生的炎性介質IL-6進行檢測含量，經過以上實驗得到的結果顯示，青藤堿可使關節模型中的炎性因子IL-6的含量降低。青藤堿能抑制Ⅱ型膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠巨噬細胞中IL-1β和IL-6的產生，降低血清中IL-1β和IL-6的濃度[23]。研究表明[24],青藤堿顯著抑制IL-6的分泌，對骨破壞具有保護作用。因此IL-1β、IL-6等炎癥介質在關節滑膜炎癥時起著重要的作用。青藤堿可以抑制巨噬細胞中 IL-1β和IL-6的產生，并降低CIA大鼠的血清 IL-1β和IL-6的濃度，從而減輕滑膜細胞的炎癥反應。故青藤堿在治療類風濕關節炎和強直性脊柱炎可通過對IL-6抑制，可能與其緩解關節滑膜的炎癥機制有關，這可能成為將來治療的重要的靶位[25]。

基質金屬蛋白酶是一種內源性蛋白水解酶，能夠分泌多種細胞因子，可直接降解軟骨和骨質，被認為是破壞關節軟骨最為重要蛋白酶。在疾病活動時首先激活MMP-3(金屬基質蛋白酶3,matrixmetalloproteinase-3)，然后使其他的蛋白酶活化。滑膜細胞、軟骨細胞以及成纖維細胞等都可以分泌MMP-3。過度增殖的滑膜細胞中含有MMP-3，其活化可導致多種蛋白酶降解，是骨破壞骨侵蝕中起著重要作用的一種酶。因為MMP-3直接參與了骨關節的破壞[26],大量的研究表明免疫性疾病患者血清 MMP3 水平明顯升高，該指標可作為疾病活動性和療效評估的指標之一[27-28]。在類風濕關節炎和強直性脊柱炎發病時血清及關節液中的基質金屬蛋白酶含量較前明顯升高，其蛋白和基因均過度表達，青藤堿可直接顯著抑制金屬基質蛋白酶3表達使其生成減少，對減輕患者關節的破壞非常有意義。有學者進一步實驗證實青藤堿抗CIA小鼠關節炎的機制與CIA小鼠關節滑膜腔內MMP1及 MMP3 的水平下降有關[29]。有研究表明MMP3可能與強直性脊柱炎的易感性有關，是潛在診斷生物標志物[30]。還有研究表明MMP-3和MMP-9在 RA 滑膜炎和心血管變化中起著關鍵作用，使它們成為重要的治療靶點[31]。本實驗研究結果表明青藤堿對大鼠滑膜細胞株RSC-364的炎性因子MMP-3分泌水平呈顯著抑制作用，從而得知青藤堿對減輕關節的破壞非常有意義。通過本實驗，我們得出如下結論：青藤堿在不同濃度的情況下對大鼠滑膜細胞株RSC-364在IL-1β誘導下的增殖具有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴性，與此同時還可明顯降低炎癥因子IL-6、MMP-3的表達水平。由此說明青藤堿具有抑制關節滑膜炎癥、增生以及炎癥介質釋放作用。