實驗動物屏障設施管理中面臨的生物安全問題及對策探討

楊玉琴

(上海市第一人民醫院實驗動物中心,上海 200080)

《中華人民共和國生物安全法》明確指出，生物安全是國家安全的重要組成部分，是指有效防范和應對危險生物因子及相關因素威脅，生物技術能夠穩定健康發展，人民生命健康和生態系統相對處于沒有危險和不受威脅的狀態，生物領域具備維護國家安全和持續發展的能力。實驗動物生物安全是指在生產或使用實驗動物過程中，有效防范和控制實驗動物或動物實驗研究對環境和人類可能產生的潛在風險或現實危害。目前，幾乎所有生命科學領域的科研、教學、生產、檢定、安全評價和成果評定都離不開動物實驗。科學研究中使用實驗動物的種類、品種、品系和數量越來越多，實驗動物生物安全已引起國內外高度重視。這種生物安全的危險來自實驗動物本身所攜帶的人獸共患病或實驗室獲得性疾病，這些疾病病原給人和環境帶來感染的風險［1］。Mark 等［2］分析發現，目前已知1 145種人類傳染病中超過60%為人獸共患病，從1991年至今報告的24種新發傳染病中有16種是從動物傳播來的，包括2003 年暴發的嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和H7N9 型禽流感疫情。還有文獻［3］報道，幾乎每年都會有一種或兩種新發或再現的病原體感染人類并傳播，從長遠看，這樣的發展速度意味著人類將面臨著被疾病大肆侵害的危險。

針對實驗動物生物安全，我國一直在完善相關的國家標準和法律法規：1994 年頒布第一版實驗動物國家標準GB 14922.2—1994 和GB 14925—1994，其中實驗動物分為普通級、清潔級、無特定病原體級和無菌級，實驗動物設施分為開放系統、亞屏障系統、屏障系統和隔離系統；2001 年第二版的實驗動物國家標準GB 14922.2—2001 和GB 14925—2001 中取消了普通級大小鼠和亞屏障環境；2011 年第三版的實驗動物國家標準GB 14922.2—2011 和GB 14925—2010 中對污水、廢棄物及動物尸體處理有了較具體的規定；2020 年第四版的實驗動物國家標準征求意見稿GB 14922.2—2020中取消了清潔級動物分類。2021年4月15日開始實施的《中華人民共和國生物安全法》標志著我國生物安全進入依法治理的新階段。屏障設施是目前開展動物實驗研究中建造和使用數量最多的一種實驗動物設施［4］，因此對該類設施中生物安全管理需要進行深入研究探索。2021年羅銀珠等［5］曾探討了病原微生物防控在實驗動物設施管理與生物安全控制中的作用。本文將以上海市第一人民醫院實驗動物中心的生物安全管理經驗為基礎，圍繞實驗動物屏障設施管理中涉及的三個主體即實驗動物、人員和環境可能存在的生物安全問題進行分析并提出相應對策，以期為國內同行提供參考。

1 實驗動物安全

實驗動物是動物設施生物安全防控中最為重要的一環。屏障設施建設和管理的主要目的是在保障動物安全的前提下順利開展實驗，但在動物的引進、飼養和實驗中都存在病原微生物感染、繁殖及向環境、人類擴散的風險，從而出現生物安全問題。近年來發生的多起生物安全相關事故即反映了這個問題，如2001年北京某高校因使用不合格動物、動物實驗操作不規范而發生鼠源性人獸共患病流行性出血熱，致使1 名教職人員死亡和700 多名師生隔離；2011 年黑龍江省某高校的27 名學生及1 名教師因使用4 只未檢疫山羊進行實驗而感染布魯氏菌病；2021 年北京某設施的一名獸醫因感染猴B 病毒而死亡［6-7］。因此加強對實驗動物及實驗動物設施等各方面的生物安全管理顯得尤為重要。

1.1 引進實驗動物的安全

引進實驗動物是使用實驗動物的第一道流程。加強實驗動物質量管理，完善動物檢驗檢疫體系，能從源頭上避免生物安全事故的發生，并且減少生物安全隱患。實驗動物的引進主要有以下幾個途徑：國外公司和科研院所、國內生產實驗動物的公司和科研院所。

1.1.1 來源于國外有資質公司和科研院所的實驗動物安全管理

進口實驗動物主要是從國外的實驗動物公司和科研院所引進。隨著實驗動物進口數量的增加，輸入病原微生物的風險也會逐漸增加。國內首次發現小鼠牛棒狀桿菌就是從進口的裸鼠體內分離獲得。2010 年一批經上海海關進口入境的裸鼠在隔離期間皮膚表面出現了白色鱗片狀樣物質，短時間內80%的小鼠都出現了相同的癥狀，經鑒定為牛棒狀桿菌。此前該病在日本、美國和意大利的實驗動物設施內暴發，是國外實驗動物供應商重點監測的裸鼠疫病之一，但在我國尚未有發生該病的動物病例報道［8］，也未將其作為檢測項目列入進境動物檢疫疫病名錄內。因此，2020 年1月農業農村部會同海關總署組織發布了新的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》，里面涉及了很多國內外常見的病原微生物，目前從國外引進的實驗動物均按該名錄內的項目進行檢測，盡量避免新型病原微生物的輸入。經過入境口岸隔離檢疫后的動物，在進入設施時還應按實驗目的及進入的設施區域不同，采取不同的檢驗檢疫方法。我院實驗動物中心的經驗是：如后續做動物實驗，在進入實驗區前需要對動物進行隔離檢疫，隔離檢疫期間進行一般狀態觀察和/或病原微生物檢測；如后續開展長期的保種繁殖，則在進入繁殖區前還需要完成生物凈化。

1.1.2 來源于國內實驗動物生產公司的實驗動物安全管理

目前，國內實驗動物生產公司的動物質量逐年提高，但個別公司由于一些原因也存在動物病原微生物感染的情況。若攜帶按國標需排除的病原微生物的動物直接進入設施，會給實驗動物設施帶來較大的生物安全風險［9-10］。因此，我院實驗動物中心對目前國內主要的實驗動物生產單位進行篩選，挑選出有資質的可信任供應商，與之建立長期合作關系，以保證實驗動物的質量。并根據訂購動物的來源不同，采取不同的管理方法。如實驗動物來自可靠的供應商且進入實驗區做實驗前，需對實驗動物進行隔離檢疫和適應性飼養；在此期間，應對實驗動物進行一般狀態觀察和動物病原微生物的隨機抽檢。如實驗動物來自非可靠供應商，檢疫內容主要包括動物一般狀態觀察和動物病原微生物的每批按比例檢測。對于計劃開展長期保種繁殖的動物，均需生物凈化后方可進入繁殖區。

1.1.3 來源于國內有資質科研院所的實驗動物安全管理

目前，國內各科研院所的實驗動物設施硬件條件參差不齊，動物病原微生物管控側重點也不盡相同［7］。故來源于科研院所的實驗動物直接進入設施，潛在風險較大，需要嚴格控制。我院實驗動物中心的要求是：如動物需進入實驗區做短期實驗，需對每批動物進行隔離檢疫及適應性飼養，隔離檢疫期間對實驗動物進行一般狀態觀察和按比例病原微生物檢測；待實驗動物監測合格后，方可從檢疫室進入飼養室。進入繁殖區開展長期保種繁殖的動物，先需要完成生物凈化。

1.2 動物飼養過程中的安全

規范實驗動物的飼養是屏障設施管理的核心，也是實驗動物使用的最基本保障。屏障內實驗動物的規范飼養應符合國家標準，除硬件設施外，還應有與之相匹配的軟件管理體系。2007 年廣州市某高校實驗動物中心發生了實驗人員感染腎綜合征出血熱的事件，其原因就是設施內飼養的大鼠被外源性野鼠感染了出血熱病毒［11］。因此，在設施管理中要保證進入的物品、人員和動物的可控性，不能進入的堅決禁止，同時做好內部飼養、消毒和檢測工作，保證設施的正常運行，降低實驗動物感染風險，減少生物安全事故的發生。

1.2.1 飼養相關物品和籠器具的安全管理

進入設施中與飼養相關的物品主要包括水、飼料、墊料和動物籠盒等。如果物品傳入管理不當會給整個設施帶來嚴重的污染問題，故相關物品必須保證無菌。目前我院實驗動物中心的要求是：飲用水需經反滲透過濾制備或高溫高壓滅菌，灌裝存放有效期不應超過5 d；墊料和動物籠盒必須經過高溫高壓滅菌后進入；袋裝輻照飼料需用消毒水浸泡，確認其外包裝的密閉性后，經噴霧結合紫外消毒的方式處理后進入；潔凈的籠具在設施內有效存放時間不能超過2 周。物品在設施內移動都應保持單向流動：潔物間→清潔走廊→動物飼養室或實驗室→污染走廊→緩沖間→清洗間。即從相對潔凈的區域流向相對污染的區域，不能反向流動。同時制定嚴格的清潔消毒制度，清潔消毒需由專人負責，定期檢查。定期做好籠盒、水瓶的更換和儀器設備及環境的消毒工作，動物飼養籠盒每1～2周更換一次，飲水瓶按需更換，設施內部每周整體打掃消毒一次；每批動物實驗結束后，必須更換該批動物的籠具、水瓶，用消毒液擦拭籠架后，方可開展下一實驗；飼養室每3～6個月清空一次，進行整體消毒等。

1.2.2 防范野生動物進入和設施內部動物逃逸的安全管理

野生動物是很多人獸共患病的宿主［12-13］，見表1。屏障設施有非常高的密閉性，但設施外圍的野鼠、昆蟲數量眾多，極可能在設施門開閉時進入，防不勝防。一旦與設施內實驗動物接觸或污染飼料墊料，極有可能引發生物安全事故。因此，必須做好防蟲防鼠的措施。我院實驗動物中心采取的措施主要包括以下三點：首先，清除吸引或支持害蟲生存的環境因素，加強設施周圍的環境治理，垃圾和積水是野生鼠和蚊蟲繁殖和生存的重要條件［14］，因此制定了相應的管理制度并及時清理垃圾和積水，搞好外圍環境衛生；其次，消除野生動物潛在入口，在設施的各個進出口設置擋鼠板，對進入人員加強隨手關門的教育和管理，防止開門時野鼠乘機進入；最后，可以采用器械和藥物對野生鼠和蚊蟲進行捕抓，如在一定范圍內設置誘餌等。

表1 野生嚙齒類動物攜帶的常見人獸共患病原微生物Table 1 Common zoonotic protomicroorganisms carried by wild rodents

設施內部動物的管理也非常重要。屏障設施是一個動態的系統，空氣環境、物品和實驗動物都在不斷的更新，因此需要加強防護，降低因某間飼養室或某只動物感染造成影響范圍和危害程度擴大。在屏障設施內開展各種需要打開籠盒的操作，條件允許時盡量在負壓操作臺內進行。發現實驗動物逃逸，應迅速關閉門，及時進行抓捕。要查明逃逸原因，并制定相關措施，防止實驗動物再次逃逸。原則上逃逸動物一律處死，做好相關記錄。如因實驗需要必須保留此動物，實驗人員須給出充足的理由并降級別飼養。

1.2.3 具有潛在風險的特殊品系動物安全管理

基因修飾動物是通過基因工程和克隆技術獲得新的實驗動物模型。目前，基因修飾動物應用范圍非常廣泛，數量龐大，但其遺傳物質變化帶來的風險一般無法在表型上鑒別，可能會對自然環境和人類健康造成潛在的威脅［15］。尤其是當使用這些實驗動物的人員不能確保正確合理的操作和管理，使其逃逸到自然環境中，與同種類動物發生遺傳物質的交換和傳代，就可能把人類疾病的易感基因轉移出去，造成傳染性疾病的大流行，破壞生態環境平衡，直接危害人類健康。另外免疫缺陷動物由于免疫功能較低，很容易被環境和人的病原微生物感染，形成病原微生物的放大效應，且該動物主要被應用于細胞和生物樣本的接種實驗，也易引發生物安全事故［16］。因此，我院實驗動物中心對于這些特殊品系的動物安排獨立的房間和飼養人員進行飼養，減少與其他實驗動物接觸。

1.2.4 設施整體和處理系統的安全管理

影響實驗動物健康的因素非常復雜，不同的病原微生物傳播途徑也不盡相同。一旦設施內部某個環節發生問題，又未及時發現和處理，即會造成重大的污染事故。因此要建立定期對實驗動物屏障設施進行監測和優化的管理體系。

我院實驗動物中心的監測內容主要包括以下幾個方面：設施環境方面，每三個月對設施內部環境、儀器設備表面和進出風口進行病原微生物檢測；實驗動物方面，飼養人員每日觀察，結合獸醫每周巡檢和每三個月對哨兵鼠進行國家標準以上的病原微生物檢測；物品方面，不定期對傳入設施內部的飼料、墊料和水進行病原微生物檢測。監測到以上任何一方面有問題，都需要從這三個方面進行排查，確定問題原因和范圍。如果僅僅是環境或物品出現問題，未影響到實驗動物，那么處理相對簡單，可以加強消毒并嚴格管控物品。如果出現患病動物，則需要進一步確定患病動物范圍和是否為傳染病。如果是個別動物患病，應將異常動物放入隔離室單獨飼養，獸醫確認患病原因，與項目負責人商議是否治療或者處死；如需治療，應詳細記錄治療的理由、批準手續、檢查情況、藥物處方、治療日期和結果（治療原則以不影響試驗結果為準）；如需處死，則采取安樂死方法，尸體置于冰柜暫存。如果是整群動物患病，則由獸醫人員和項目負責人確診，不能排除時請獸醫專家會診結合有關單位檢測來確定；若診斷為傳染性疾病，應立即處死所有患病動物并交給有資質的醫療廢物處置機構，按《中華人民共和國動物防疫法》進行無害化處理，同時對整個設施內所有動物進行檢查，核查被感染的范圍，及時上報當地的實驗動物管理和動物防疫監督機構。

1.3 動物實驗過程中的安全

能高效開展動物實驗且獲得有效的實驗數據是使用實驗動物的根本目的。動物的引進和飼養都是為動物實驗開展提供的基礎保障。但開展動物實驗的過程中涉及到人員、實驗物品和動物的相互交叉，如不能有效控制其潛在風險，易引發重大的生物安全事故。

1.3.1 實驗項目的安全管理

為了保證動物實驗的順利開展，所有在設施內開展的實驗項目均需向該設施所在單位的實驗動物倫理委員會提交申請，對該實驗項目開展的必要性、實驗方法、倫理福利措施及設施是否符合動物實驗要求等進行審核。需要強調，屏障設施不能開展涉及病原微生物等的感染類實驗。

1.3.2 實驗材料的安全管理

實驗人員所攜帶的動物實驗材料也是“屏障關”較難控制的方面。我院實驗動物中心對實驗材料進入屏障的總體管理原則是分類傳入：可高壓物品必須高溫高壓處理；不耐高溫的物品可以用消毒液噴霧或紫外照射；既不耐高溫高壓，也不能采用消毒液浸泡處理的物品，可用消毒液熏蒸處理后進入。在外配制的試劑和細胞，需留樣抽檢。對于難以消毒滅菌的碎冰、手機等，禁止傳入；可以在屏障內配置高性能的相機或平板電腦，方便數據的收集。在屏障內外放置低溫金屬浴，以保障需要在低溫保存試劑和細胞的實驗的順利開展。此外，生物材料在實驗動物模型制作方面的廣泛應用也為實驗動物防疫安全提出了挑戰。因此，在生物安全管理上尤其要做好各種來源的生物材料安全性檢測，防止攜帶人源或動物源傳染性病原的標本用于實驗動物。

1.3.3 實驗人員操作的安全管理

在醫院和高校的動物屏障設施內實驗人員人數較多且進出頻繁，是屏障環境防疫安全較難控制的因素。實驗操作過程中的任何不規范現象，都會對實驗結果、動物和環境造成不良的影響。對申請進入設施開展動物實驗的人員要進行理論和實踐方面的培訓，包括設施使用、動物實驗技術和無菌手術操作等，讓實驗人員嚴格遵守操作規程，規范化、程序化、標準化地開展動物實驗，減少在設施內獨立開展實驗時發生生物安全事故的概率。同時獸醫在屏障設施內巡查時，應對實驗人員進行動物實驗操作過程中出現的問題進行及時糾錯，以保證將人員危險因素降到最低。

1.3.4 實驗中取出動物的安全管理

在實驗動物屏障設施內開展各種類型的實驗，需要的儀器設備也各式各樣，但在設施內無法配全所有的儀器設備，因此就會出現有一部分實驗需要將動物取出設施，在設施外完成實驗。但取出后動物是不能再返回屏障設施內的，因此很多單位都會在屏障外設置一個暫養區［17］。在該區域可以短期內繼續進行實驗觀察，把潛在的風險排除在屏障設施之外，避免屏障內其他動物受到影響。

暫養區作為屏障設施外的一個有效的補充區域，不僅降低了取出的實驗動物在屏障設施外實驗區域發生安全事故概率，也保障了實驗的順利開展；但放置在暫養區的動物因為均在外部暴露過，被感染的概率非常高，因此需對暫養區房間及動物加強管理。我院實驗動物中心目前主要在設施條件、動物飼養和取出動物返還等方面加強了管理。暫養區的內部設有獨立通氣籠盒和負壓換籠工作站，飼養、消毒管理與屏障系統一致；飼養在暫養區的動物不允許繁殖，且飼養時間不能超過2 個月；同時設置哨兵鼠對該區域內動物的病原微生物進行監測。

凡允許返回到暫養區的實驗動物需滿足以下幾點：⑴實驗動物移至屏障環境外的實驗室，必須通過單位實驗動物倫理委員會的審查；⑵實驗人員在運輸該批實驗動物時，選擇了合適的運輸工具和運輸方式，并保證了動物的生物安全且符合倫理要求；⑶該批實驗動物在區域外未與其他不明來源的動物接觸，未接觸可能存在污染風險的儀器設備；⑷返還的實驗動物規格（品系、數量、周齡等）須和取出的實驗動物一致，如有數量的變化需標明及記錄。獸醫將對返回的實驗動物按國家標準進行定期抽檢。

2 實驗和飼養人員安全

目前，在屏障設施的生物安全管理過程中，人們關注點大多集中在動物的安全上，而對于實驗和飼養人員的人身健康及生命安全的關注較少［18］。由于實驗或飼養人員會與實驗動物及排泄物直接接觸，所以一旦發生人獸共患病或操作意外，即可能造成較嚴重的后果。因此，必須加強對實驗和飼養人員的生物安全防護工作。

2.1 安全防護設備的配備

屏障系統內必須配備安全防護設備。安全防護設備可分為個人防護設備（personal protective equipment，PPE）和生物安全柜（biosafety cabinet，BSC）［19］。PPE是對實驗和飼養人員的重要保護屏障。因此進入設施應正確穿戴防護裝備，如手套、口罩、鞋套、隔離服等。實驗人員手上有皮膚破損或皮疹時應戴雙層手套；實驗人員進行動物抓取操作不熟練時，需佩戴防咬手套；針對可能發生的實驗動物咬傷或抓傷，手術器械如手術針、手術刀、手術剪、注射器等銳器刺傷等傷害事件，設施內需要配備利器盒，設施外需配備醫療急救箱等，以提高整體防護等級，保護實驗人員安全。

在實驗動物飼養和實驗開展過程中有很多操作可能產生氣溶膠［6］，尤其在籠盒更換、動物實驗解剖、臟墊料處理過程中，實驗或飼養人員會直接接觸動物及其排泄物，如果實驗動物患有人獸共患病，其產生的大量的微生物氣溶膠會對相關人員造成危害。BSC是目前最常用且最有效的實驗室生物安全防護設施，它可以將傳染性氣溶膠限制在一定空間內，使其不會擴散出去危害操作者。因此在我院實驗動物設施內各個操作間配備相應的負壓的換籠工作站、生物安全柜，在設施外放置了負壓墊料處理柜，以上措施可有效減少氣溶膠導致的人員生物安全事故的發生。

2.2 安全培訓體系的建立

為了確保人員安全，實驗動物設施的管理者需建立一套知識面廣、內容細致且可行性強的課程體系，包括人員個人防護、實驗動物技術操作和儀器使用操作規范等，通過培訓不斷加強飼養及實驗人員的自我保護意識［20］。內容可包括但不限于：根據實驗動物設施生物安全個人防護的配備原則，穿著合適的PPE；規范實驗動物技術操作，加強熟練性訓練，逐步掌握正確的防護措施，從而有效避免針刺傷、銳器傷和動物咬傷等傷害事件；正確使用設施內的各種儀器設備，加大儀器標準操作的宣傳力度，以充分發揮設備的防護作用。例如，可將實驗動物相關安全概念及危害等做成展板海報，貼在實驗動物設施的宣傳欄內。

3 環境安全

在實驗動物設施運行過程中，主要產生固體、液體和氣體三種形式廢棄物［21］，如果按照普通生活垃圾處理，將固體廢棄物隨意丟棄，液體廢棄物直接排入下水道，氣體廢棄物直接排放到周圍大氣中，不僅污染環境，還增加傳染性疾病傳播的概率，給人類日常生活帶來巨大的威脅。因此，應對實驗動物廢棄物進行分類收集，通過相應設備進行處理后排放或者交由有資質單位進行無害化處理。

3.1 液體廢棄物的排放

液體廢棄物主要是由清洗動物籠具及各種實驗用品產生的大量含有實驗動物排泄物的污水［22］。感染性動物因含有大量的病原菌，其廢水不宜直接排放，要先經消毒處理；非感染性動物廢水可不進行消毒，但所有廢水的氨氮和其他指標需達到相應的國家和地方標準后方可排入市政污水管網。

3.2 氣體廢棄物的排放

氣體廢棄物主要是由動物糞尿發酵分解產生的具有特殊氣味的有害氣體，主要含有氨、氯、硫化氫和硫醇等。廢氣未經過有效處理就直接排放，會對周邊環境造成很大程度的污染，需要在設施的排風系統末端連接除臭設備，經過濾除臭，達到相應的國家和地方標準后再進行排放。

3.3 固體廢棄物的排放

固體廢棄物主要是實驗產生的廢化學試劑、動物糞便混合的飼料、墊料、動物尸體及更換的各類過濾器，均應作為醫療廢棄物，委托當地的固體廢物處置中心或有資質的公司進行專業處理［23］。

4 結語

21 世紀以來，全球范圍內發生的公共衛生事件中，人獸共患病所占的比例不斷增加［24］。人類、動物和環境的聯系越來越緊密，“同一健康（One Health）”理念應運而生。這一理念注重人類、動物和環境健康間的關聯性，強調跨學科、跨部門、跨區域的合作，重視環境在疫病傳播過程中的作用，旨在實現人類、動物和環境的整體健康［25］。屏障系統作為目前我國建造和使用數量最多的實驗動物設施，對其涉及的動物、人員和環境的生物安全風險進行有效的分析評估，并建立其相應的生物安全防范措施，才能實現安全管理，保障動物相關教學、科研有條不紊地進行。希望筆者的探索和嘗試可為其他實驗動物屏障系統的生物安全管理提供參考和借鑒。