文冠果種子不同發育期內源激素的動態變化

王鵬俠，阮成江，杜 維，趙 振

(1.甘肅省渭源縣林業和草原服務中心，甘肅 渭源 748200；2.大連民族大學 資源植物研究所，遼寧 大連 116600；3.吳忠市協貴厚種植專業合作社，寧夏 吳忠 751100)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)是中國北方特有的木本油料樹種，廣泛分布于遼寧、內蒙、寧夏、甘肅和新疆等地[1]。文冠果具有耐旱、耐鹽堿、耐寒和適應沙地等抗逆特性，可以在土壤貧瘠和氣候干旱的地區種植[2]。文冠果種子含油率可達35%以上、種仁含油率可達67%以上，油脂中含有豐富的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸和神經酸等[3]。

植物種子發育受內源激素的嚴格調控，如生長素和赤霉素可促進種子膨大、脫落酸可促進糖酸形成等[4,5]。但生長素(IAA)、細胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)在文冠果種子發育過程的動態變化仍不清楚。本文以不同發育期文冠果種仁為實驗材料，經固相萃取提取純化內源激素，利用液質聯用法(LC-MS)分析不同發育期文冠果種仁內源激素的動態變化及其對種子發育的影響，旨在為理解內源激素對文冠果種子發育的調控規律提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

文冠果不同發育期種子分別于2019年采收自寧夏回族自治區吳忠市國家農業科技示范園區文冠果基地。選取花后50天(50 days after flowering DAF 前期)、65天(65 DAF中期)、80天(80 DAF 末期)和95天(95 DAF成熟期)4個發育期，采收時選取發育良好的果實，取出種子混合后用錫紙包裹液氮速凍，干冰運輸回實驗室以后，保存于-80 ℃冰箱中、備用。

1.2 種子含油率測定

選取50、65、80和95 DAF 4個發育期種子，剝種皮后對種仁進行形態觀察并拍照。

采用氯仿甲醇法測定文冠果種仁含油率[6]。將烘干的文冠果種仁研磨，精確稱取0.3 g研磨后的種仁并轉移至1.5 ml離心管中，加入含有60%氯仿的甲醇溶液，劇烈震蕩1 min后于4 ℃冰箱中靜置過夜。過夜靜置后10 000g離心5 min，上清液轉移至新離心管中，加入300 μL 1% KCl溶液震蕩5 min，震蕩后10 000g離心5 min，棄上清液，將下層氯仿相轉移至重量已知的離心管中。風干或真空濃縮氯仿相，稱重后與空管差值即為種仁的含油量。每個樣品做3次重復。

1.3 內源激素提取純化與檢測方法建立

采用甲醇法結合固相萃取提取和純化種仁內源激素[7]。將樣品從低溫冰箱取出，液氮研磨后稱重(1～2 g)轉移至10 mL離心管中，加入5 mL 體積比為75%甲醇、5%甲酸水溶液過夜提取。10 000g離心20 min, 加入2 mL提取液清洗沉淀2次，合并離心后的提取液，離心濃縮至溶液體積為3 mL，濃縮后用1 mol·L-1甲酸溶液定容至10 mL。MCX固相萃取柱對提取液進行純化：用2 mL甲醇純化，2 mL 1%甲酸溶液平衡，進樣后先用2 mL甲醇洗脫得到IAA、ABA和GA3，用3 mL氨化甲醇(含有0.35 mol·L-1氨水、60%甲醇的水溶液)洗脫得到CTK。合并洗脫液，用甲醇定容至10 mL。上樣前樣品經過0.22 μm濾膜過濾，由于植物內源激素易見光分解，提取時應用棕色容器避光操作。

采用液質聯用法對純化后的內源激素進行測定[7]，液相條件為：A為1%甲酸溶液，B為甲醇溶液。洗脫程序：0～5 min 10% B，5～20 min 10%～90% B，20～25 min 90% B, 25.1～35 min 10% B。色譜柱為C18柱(150 mm×4.6 mm)，流速為1 mL·min-1，柱溫40 ℃。質譜采用ESI離子源，離子化電壓為+5500 V，TEM：550℃，MRM模式下優化IAA、GA3、ABA和CTK的檢測條件以增加離子信號強度，提高檢出限。4種植物內源激素采用外標法定量，樣品測定峰面積與標準曲線對比，計算對應激素的濃度。

2 結果與分析

2.1 文冠果種子發育過程形態學觀察

寧夏吳忠文冠果花期為5月上中旬，隨后進入種子發育期。6月下旬至8月初為種子發育到成熟期圖1。50 DAF時，種皮白色、種仁綠色，種子硬度較低，含水量較高；65 DAF，種皮由白色變為黃棕色，種仁變大的同時葉綠素逐漸降解，種子含水量不斷下降，硬度有所提高；80 DAF，種皮逐漸脫水木質化，顏色由黃棕色變為棕色，種仁體積進一步增大，顏色逐漸變淺；95 DAF果實成熟時，種子顏色變為黑色，硬度較高，種仁葉綠素完全降解，顏色變為白色。

(注：左至右時期分別為：50、65、80和95 DAF)

2.2 文冠果不同發育期種子含油率變化

文冠果種子含油率隨發育進程迅速升高，文冠果不同發育期種子含油率變化如圖2。50 DAF種子含油率僅為7.13%，50～65 DAF為種子油脂快速合成積累期，含油率由7.31%快速升高到31.47%，增長率為341%。65 DAF后種子油脂合成積累速率減慢，到95 DAF上升到41.1%。由此可見，50～65 DAF為文冠果種子油脂合成積累的關鍵時期，種子發育中后期的油脂積累對總油脂含量貢獻相對較小。

圖2 文冠果不同發育期種子含油率變化

2.3 內源激素提取純化與檢測方法建立

對質譜參數進行優化，結果見表1。IAA和CTK為正離子掃描模式，定量子離子荷質比(m/z)分別為130.2和136.3。ABA和GA3為負離子掃描模式，定量子離子分別為153.1和239.2。調整每種內源激素的碰撞能量和去簇電壓以得到最高響應值，內源激素GA3在負離子模式下母離子345.1只能產生1種對應的子離子。對濃度范圍10～500 ng·mL-1的標準品溶液進行測定，得到4種內源激素標準品峰面積和對應濃度呈現良好線性關系，標準曲線相關系數(R2)均大于0.99，符合外標法定量要求。

表1 4種內源激素MRM參數和標準曲線方程

4種內源激素50 ng·mL-1的LC-MS/MS圖如圖3。內源激素根據非極性由弱至強，出峰時間依次為CTK 4.5 min、ABA 13.8 min、GA318.1 min和IAA 24.1 min。無雜峰且峰型對稱，無明顯前沿和拖尾現象。由于試驗采用質譜多反應監測模式(MRM)進行信號采集，避免了單獨使用高效液相色譜法時植物細胞內色素、黃酮和多酚等非極性生物活性物質對目標出峰產生的干擾。

圖3 4種內源激素LC-MS/MS圖

2.4 文冠果種子發育過程內源激素變化

文冠果種子發育過程中，不同種類內源激素含量變化規律存在明顯差異，動態變化如圖4。IAA含量在種子發育前中期保持穩定(0.90 nmol·L-1)，發育末期略有下降(0.63 nmol·L-1)，但種子成熟時IAA含量急劇上升，是發育前中期的1.78倍，達到1.6 nmol·L-1。說明種子發育后期IAA含量升高可能利于促進種子脫水成熟及休眠，與Liu的研究結果一致[8]。

GA3含量隨文冠果種子發育進程呈下降趨勢，50、65 DAF濃度分別為0.19 nmol·L-1和0.13 nmol·L-1，發育末期和成熟期穩定在0.038 nmol·L-1和0.026 nmol·L-1。GA3與植物細胞代謝速率相關[9]，GA3含量降低反映出文冠果種子發育過程細胞代謝逐漸減緩，直至成熟時降至較低水平。成熟后隨著脫水的進行，種子逐漸進入休眠，代謝速率降至最低。這與GA3作為細胞代謝強度的指標反映著植物細胞活性[10]的結果相一致。

在不同發育期文冠果種子中，ABA濃度最高時較其他三種激素最高濃度高8～50倍左右如圖4。在不同發育期種子中，ABA濃度隨種子發育進程而呈明顯下降趨勢。種子發育前期(30 DAF)，ABA濃度高達10.79 nmol·L-1，中后期逐漸降低，成熟期降至最低點(0.78 nmol·L-1)。ABA在調控種子發育成熟和產物合成積累等方面起到重要的調控作用，高濃度的ABA可以促進碳水化合物和脂類的合成與積累[11]。文冠果種子含油率在發育前中期增速較快可能與ABA濃度較高相關，前中期高水平的ABA對應文冠果種子油脂的快速合成積累。

a) IAA b)GA3

CTK在文冠果種子發育前中期維持較高水平(0.38 nmol·L-1、0.51 nmol·L-1)，但后期和成熟期逐漸降至較低水平(0.13 nmol·L-1、0.02 nmol·L-1)。前中期高水平的CTK可促進文冠果種仁細胞分裂，使種仁體積在前中期有較快幅度的增大，這與CTK可促進細胞分裂、分化[12]的結果相一致。

3 結 語

文冠果種子含油率隨發育進程逐漸升高，前中期是種子油脂形成的關鍵時期。不同發育期文冠果種子不同內源激素動態變化的差異明顯，IAA在果實成熟時含量最高，可促進種子脫水成熟；GA3隨果實發育過程含量逐漸降低，與種子細胞活性一致；ABA濃度與含油率增長速率成正相關，高濃度ABA有助于文冠果種子油脂的快速積累；種子發育前期CTK含量較高，可促進文冠果種仁體積的增大。

植物種子發育的激素調控網絡十分復雜，內源激素、轉錄因子以及相關信號分子一起控制這一復雜過程。文冠果種子內源激素動態變化的研究有助于從激素水平揭示文冠果種子生長發育的調控機制，也可為制定提高種子含油量的調控措施提供科學參考。