基于數據挖掘與網絡藥理學分析陳可冀主編之清宮系列書籍治療骨關節炎外用方的用藥規律*

張婷 曾建偉 戴雨婷 吳廣文 陳俊

（1 福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室福州 350122；3 福建中醫藥大學中西醫結合學院 福州 350122）

骨關節炎（OA）是關節炎最常見的形式，也是全球慢性疼痛和殘疾的主要來源，特別是膝骨關節炎，且其為退行性病變，患病率隨著年齡的增長而增加。OA 系由創傷、肥胖等諸多因素引起的關節軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生[1]。按照國家中醫藥管理局制定的中華人民共和國中醫藥行業標準[2]，OA 屬于骨痹范疇。臨床上以患病關節疼痛、腫脹、僵硬、活動受限為最常見癥狀[3]。中醫藥在OA的防治方面具有一定優勢[4]。結合現代研究[5～7]OA 證候分類可分為腎虛髓虧、風寒濕阻、瘀血阻滯、痰瘀互結等證型。由于所處朝代靠后及診療對象地位特殊，一些學者認為清代御醫博通經籍，其在辨證論治、選方用藥方面經驗豐富且嚴謹慎重、竭心盡力，療效往往較為顯著[8～10]。清宮系列書籍由國醫大師陳可冀院士主編。筆者以該書為基礎，收集其治療OA的方劑，利用數據挖掘技術，整理、分析清宮治療OA 的用藥規律及組方規律，以期為清宮系列書籍治療OA 外用方劑的挖掘和傳承工作提供參考。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 原始資料采集 研究方劑來源于陳可冀主編之清宮系列書籍：《清宮醫案集成》《清宮配方集成》《慈禧光緒醫方選議》《清宮膏方精華》《清宮醫案精選》《清宮醫案研究》《清代宮廷醫學精華》《清宮外治醫方精華》。根據國家中醫藥管理局制定的骨關節炎診療標準[2]，采集其主治涉及“腰膝等關節隱隱疼痛、屈伸、轉側不利、筋骨疼痛、腳膝拘攣、骨節僵硬、筋骨不舒”等病癥的方劑。

1.2 資料數據預處理 根據本研究挖掘目標，采用的預處理方法包括數據整理、變換，即統一規范中藥名稱、簡約分割冗雜方劑[11]。對一些名稱不完整的中藥予以剔除，名稱完整中藥參照《中藥學》[12]教材將中藥名進行統一規范，形成標準名稱，如懷牛膝、懷膝、牛膝統一規范為牛膝，川獨活、獨活統一規范為獨活等。

1.3 數據挖掘方法 采用Excel 建立數據庫，內容包括具體方劑名、中藥名稱。運用中醫傳承輔助系統（V3.0）軟件（中國中醫科學院中藥研究所提供）統計每味藥物的使用頻數，并進一步分析其功效、性味、歸經。基于此進行用藥關聯分析和聚類分析，研究其用藥規律。

2 結果

2.1 藥物頻次、性味、歸經及功效統計結果 共收錄方劑103 首，涉及中藥439 味。439 味中藥共出現1 232 次，其中出現頻次≥10 次的中藥共21 味，占總藥味數的4.78%。從統計數據來看，中藥使用頻次在前10 位的是：乳香、當歸、沒藥、防風、木瓜、紅花、羌活、獨活、白芷、川芎。見表1。對中藥進行功效、性味、歸經分析，功效頻次在前4 位的是活血化瘀類、祛風濕類、解表類、補虛類；使用性溫、平，味辛、苦藥物的頻次較多，藥物歸經以肝、脾經為主。見表2～表3。

表1 醫案處方中頻次較高的藥物

續表

表3 頻次≥10 的中藥性味情況（次）

2.1.1 醫案處方中藥物的四氣分布 參照《中藥學》[12]教材對高頻中藥藥性進行歸納、統計和分析。高頻中藥以性溫為主，占比50%，其次為性平，占比23%。見圖1。

圖1 藥性圖

2.1.2 醫案處方中藥物的五味分布 參照《中藥學》[12]教材對高頻中藥藥味進行歸納、統計和分析。結果顯示高頻中藥以味苦、辛為主，分別占比37%和37%，其次為味甘，占比18%。見圖2。

圖2 藥味圖

2.1.3 醫案處方中藥物的歸經分布 參照《中藥學》[12]教材對高頻中藥歸經進行歸納、統計和分析。若一味中藥有多個歸經，則全部統計在內，結果顯示，藥物歸經以肝經（24%）、脾經（18%）、心經（14%）、肺經（10%）和腎經（10%）為主。見圖3。

圖3 歸經圖

2.1.4 醫案處方中藥物功效頻數統計 參照《中藥學》[12]教材對藥物功效進行歸納、統計和分析。結果顯示，功效頻次在前4 位的是活血化瘀類（22%）、祛風濕類（16%）、解表類（15%）、補虛類（12%）。見圖4。

圖4 功效圖

2.2 醫案處方的關聯規則分析 將支持度分別設為10%、15%、20%，藥物關聯圖用“網絡展示”。見圖5。設置支持度為10，置信度為0.7，得到常用藥對及組合。見表4。對所得藥對進行關聯規則分析。結果見表5。

圖5 中藥關聯網絡展示圖

表4 支持度≥10 的中藥組合頻次情況

表5 支持度≥10 的藥物關聯規則

2.3 方劑的聚類分析 依據關聯規則分析的結果得到的方劑聚類分析圖。見圖6。聚類得到的核心組方見表6。統計出現的18個組合中含有12 味藥，總出現的頻次為219，分析結果發現：其中含有當歸或乳香的組合出現頻次較高。且這12 味藥中的當歸、沒藥、乳香、紅花、獨活、白芷、川烏、川芎、防風9 味藥在頻次統計中頻率都排在前11，故將其視為高頻藥物。此9 味藥合用有祛風除濕、活血通經、祛瘀止痛的功效。用kmeans 算法基于其藥物種類及出現頻次將其分為五類。Ⅰ類，當歸-乳香-防風-羌活-大青鹽-醋；Ⅱ類，防風-當歸-乳香-天麻-細辛-白芷；Ⅲ類，牛膝-獨活-羌活-木瓜-甘草-防風；Ⅳ類，羌活-川烏-草烏-白鮮皮-紅花-木瓜；Ⅴ類，沒藥-乳香-當歸-木瓜-紅花-防風。見圖6A。再用kmeans 算法做出回歸模擬方程驗證其分類的合理性。見圖6B。可以作出回歸方程證明了其分類合理性，五類藥物都在回歸線附近，進一步證明了其分類的科學性。

圖6 聚類分析結果

表6 基于關聯規則分析聚類得到的核心組方

2.4 新方劑組合 基于關聯規則與聚類分析的結果，再綜合藥物的性味歸經結果，將關聯分析出的高頻藥物，加上羌活可祛一身上下之風濕，再加上細辛更可使藥力直達病所，促進藥物吸收，因而將羌活、獨活、白芷、防風、川烏、川芎、當歸、乳香、沒藥、紅花、細辛這11 味藥組合為一個新的治療骨關節炎的外用方，命名為榮筋祛痹方。其藥物占比分析見圖7。再進一步用網絡藥理學來驗證榮筋祛痹方治療骨關節炎的理論依據。

圖7 榮筋祛痹方藥物頻率統計圖

2.4.1 榮筋祛痹方藥物活性成分篩選及靶點預測將上述綜合藥物性味、歸經、功效及高頻藥物的分析結果，基于關聯分析與聚類結果組出的新方榮筋祛痹方（羌活、獨活、白芷、防風、川烏、川芎、當歸、乳香、沒藥、紅花、細辛）治療OA 進行網絡藥理學預測。登錄中藥系統藥理學數據庫和分析平臺，獲取藥物的有效化學成分，再根據化合物藥代動力學特性，以類藥性（Drug-likeneee, DL）≥0.18，分子量（Molecular Weight,MW）≤500，脂水分配系數對數值（AlogP）在1～3 之間并結合文獻檢索結果確定藥物的活性化學成分。篩選獲得了榮筋祛痹方中71種有效成分，利用STITCH、CTD 和Symmap 數據庫搜索這些活性化合物在人體的潛在靶點，共對應421個靶點。按degree 值大小將排名靠前的有效成分與靶點基因做出關系圖。見圖8。

圖8 榮筋祛痹方有效成分-靶點關系圖

2.4.2 OA 的靶點預測 登錄Genecards 數據庫獲取疾病靶點，以Osteoarthritis 為檢索詞，提取數據庫中可信度較高（score≥5）的相關靶點2 072個。

2.4.3 榮筋祛痹方-OA 蛋白互作（PPI）網絡的構建將421個藥物候選靶點與2 072個OA 疾病靶點取交集，得到榮筋祛痹方治療OA 的靶點52個，用R語言做出韋恩圖。見圖9。將“榮筋祛痹方”與“骨關節炎”的共同靶點導入STRING 數據庫，限定物種為人，去掉網絡中單一節點，其他參數不變，獲取蛋白之間相互作用信息，結果保存tsv 格式并導入Cytoscape 3.7.2 軟件繪制藥物治療OA 的PPI 網絡圖。見圖10。依據度值大小與其相關排前10 的靶點依 次 為 HIF1A、PTGS2、FOS、CCND1、CASP8、MMP2、IL4、SPP1、CDKN1A、MAPK14。

圖9 韋恩圖

圖10 榮筋祛痹方治療OA 的PPI 網絡

2.4.4 靶點基因功能富集分析 在DAVID 數據庫中進行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 分析結果生物過程（BP）主要富集在氧化反應和老化反應等方面。見圖11。GO 分析結果分子功能（MF）主要表現在細胞因子活性和受體-配體活性等方面。見圖12。GO 分析結果細胞組分（CC）主要涉及質膜筏和細胞器外膜等方面。見圖13。

圖11 BP 分析

圖12 MF 分析

圖13 CC 分析

2.4.5 榮筋祛痹方作用的核心信號通路篩選 利用clusterProfiler 對上述方法篩選出的52個藥物作用潛在靶點進行KEGG 信號通路富集分析，并篩選p.adjust＜0.05 的信號通路，結果共富集到94 條信號通路。結果顯示，52個藥物作用靶點主要分布于腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）和細胞凋亡（Apoptosis）等多個信號通路中，這表明榮筋祛痹方可以通過多條通路調控骨關節炎。見圖14。

圖14 KEGG 通路富集分析

3 討論

在中醫學中，與OA 相關的病名主要有“歷節病、白虎病、鶴膝風”，該病屬于“痹證、膝痛、骨痹”范疇[11]。中醫學認為OA 的發病原因大多是由于肝腎虧虛、氣血不足，以致風寒濕侵襲、氣滯血瘀痰凝。據文獻資料統計，目前我國OA 的臨床治療手段排名如下：中藥方劑、外用中藥進行關節沖洗、玻璃酸鈉療法、關節鏡、針灸推拿、針刀、關節置換術等[13]。由此可見中醫藥在國內OA 的臨床治療中仍然占據主體地位[14～17]。目前OA 的中藥外用治療技術手段主要有敷貼、熏洗、熏蒸、熱熨和離子導入等，手段多樣，療效顯著，副作用較小[18～19]。根據管詠梅等[20]對2004～2015年OA 外用中藥治療的相關文獻進行的頻率、關聯規則及聚類分析所得出的結論，高頻藥味及外用藥方的處方治則應為活血化瘀、祛風除濕。

本研究擬利用中醫輔助平臺軟件提供的改進互信息法、Kmens 算法 + 聚類、Kmens 算法 + 回歸模擬三個數據挖掘方法，實現藥物間關聯性分析，從而聚類出核心組合，對清宮系列書籍用藥組方的隱形經驗進行進一步挖掘分析，旨在為OA 的中藥外用治療提供參考與依據。藥味頻次統計顯示，祛風濕類藥（綜合解表藥中的祛風除濕類藥物）最多，用量最大，其次為補益藥、活血化瘀類藥物。故中藥外用在OA 的臨床治療原則應為“祛風除濕、活血化瘀”，兼以補益肝腎。該原則是根據OA 的證候特點（痰濕、瘀血）及病機特征（肝腎虧虛、氣血不足）確立的。從組方中藥的性味歸經而言，以性溫平、味辛苦、歸肝脾經的藥物使用頻次最多。以上高頻用藥來自諸多經典醫著，結合經典與臨床，可見中藥外用治療OA旨在對癥治療，緩急止痛。

聚類分析所得五類核心組合，大都以祛風濕、活血化瘀類藥物為主。Ⅰ類當歸、乳香、防風、羌活、大青鹽、醋；Ⅱ類防風、當歸、乳香、天麻、細辛、白芷；Ⅲ類牛膝、獨活、羌活、木瓜、甘草、防風；Ⅳ類羌活、川烏、草烏、白鮮皮、紅花、木瓜；Ⅴ類沒藥、乳香、當歸、木瓜、紅花、防風。以第Ⅴ類藥為例，其中防風祛風止痛，而木瓜舒筋活絡、勝濕除痹止痛，兩者合用共奏祛風勝濕止痛之功。乳香、沒藥、紅花發揮活血止痛的作用，再配伍當歸既能補血又能活血，五藥合用共奏祛風除濕、活血化瘀、補肝腎的功效。結合中藥的性味歸經發現其用藥符合OA 內因肝腎虧虛、外感風寒濕邪、中間病理產物-血瘀的中醫發病特點。因此基于清宮系列書籍的外用方中用藥的數據分析聚類所得的核心組合是符合中醫治療骨關節炎的處方特點的，基于理論的分析能達到治療OA 的作用，所以對今后臨床用藥具有一定的指導意義。

在核心組合符合用藥規律的基礎上，總結數據挖掘的結果，組合出新方，再采用網絡藥理學在微觀水平來驗證新方對骨關節炎的治療效果，并在此基礎上指導臨床用藥。網絡藥理學的分析結果可以看出，無論是從蛋白水平還是從細胞分子水平及信號通路的角度都證明了新方在理論上是對骨關節炎有治療效果的。為進一步肯定新方的具體療效，還需進行嚴謹的動物實驗來加以驗證。本研究是基于陳可冀主編之清宮系列書籍治療OA 的用藥組方規律研究，科學整理了本書治療OA 常見用藥規律與組方邏輯，利用現代數據挖掘技術，分析用藥的關聯規則及聚類，分析得出核心組方，再總結數據分析結果組合出榮筋祛痹方，并用網絡藥理學加以驗證榮筋祛痹方治療骨關節炎的可行性。利用數據挖掘來研究清宮系列書籍并非意味著對經典閱讀的舍棄，而是利用現代技術對國醫經典進行科學的歸納總結。本研究在一定程度上改進了傳統醫案學習的不足，但是對結果的正確判讀仍然需要醫者具備扎實的傳統醫學基礎，并結合豐富的臨床診療經驗。