山香圓葉揮發(fā)油化學(xué)成分及抗氧化和抗炎活性研究

劉 昭，李 利，湯楊黔南，林麗美，夏伯候*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208；2湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙 410013

山香圓葉(別名兩指劍、千打錘、七寸釘)為省沽油科植物山香圓(TurpiniaargutaSeem)的干燥葉[1]。其主要分布于我國的江西、福建、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州等地。山香圓葉性味苦，寒；歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、利咽消腫、活血止痛的功效，對于咽喉、扁桃體、上呼吸道等炎癥或膿腫性疾病具有快速、高效的作用[2,3]。目前，山香圓葉的藥理研究主要集中在抗炎、抗菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛以及增強(qiáng)免疫等方面。基于以上活性，從山香圓葉中發(fā)現(xiàn)了100個以上的化學(xué)成分，包括黃酮、三萜、酚酸、大柱烷、鞣質(zhì)、生物堿等多種中等極性以上的物質(zhì)[4,5]，其中，黃酮是研究最為廣泛的成分，也是藥理活性最多的成分，然而，較少的研究探討其中小極性物質(zhì)(如精油)的活性及化學(xué)成分，限制了對其進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用。因此，探明山香圓葉中小極性物質(zhì)的化學(xué)成分及可能的生物活性，對于其深入的藥用價值的開發(fā)具有較好的參考意義。

揮發(fā)油又稱精油，大部分具有香氣，如薄荷油、丁香油等，其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要作用，其可治療例如前列腺癌[6]、乳腺癌[7,8]、肺癌[9]等癌癥，并且具有作為抑菌劑、抗氧化劑、抗病毒藥物和皮膚滲透增強(qiáng)劑的潛能。因揮發(fā)油的獲取方式相對其他中大極性物質(zhì)而言具有提取簡單，提取過程環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，其具有更大的開發(fā)前景和藥用價值。

因此，本研究首先應(yīng)用超臨界萃取法提取山香圓葉揮發(fā)油等中小極性物質(zhì)；再分別用GC-MS法和LC-MS法全面表征其小極性揮發(fā)性物質(zhì)和中等極性物質(zhì)，并鑒定其結(jié)構(gòu)。最后，通過基于體外的抗氧化和細(xì)胞抗炎實(shí)驗(yàn)，探討其可能的生物活性，旨在挖掘山香圓葉更廣泛的藥用價值，同時為資源的合理利用提供新思路和新方向。

1 材料與方法

多功能粉碎機(jī)(浙江江景天工貿(mào)有限公司);SQF電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);超臨界流體CO2萃取裝置(杭州華賽泵業(yè)有限公司);單四級桿氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(GCMS-QP2020，島津);超高效液相色譜(1290UPHLC，Agilent);高分辨質(zhì)譜(Q Exactive Foucus，Thermo Fisher Scientific);多功能酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo公司);CO2培養(yǎng)箱(SHEL-LAB，Sheldon Manufactring inc)。

山香圓葉購自湖南省長沙市高橋藥材市場，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)龔力民副教授鑒定為省沽油科植物山香圓(TurpiniaargutaSeem)的干燥葉[1]；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，批號：10207 0402)；Vc(Sigma-Aldrich公司，批號：101911771)；ABTS法總抗氧化能力檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：070319191112)；小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；MTT(Sigma公司，批號：1003010349)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone，批號：SH30022.01B)；胎牛血清(美國Hyclone，批號：27250-018)；LPS(Sigma公司，批號：12171104)；陽性藥物地塞米松(DXMS，北京索萊寶科技有限公司，批號：D8040)；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：MU30044)；NO Griess試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：202003)。

1.1 揮發(fā)油的提取

山香圓葉藥材在50 ℃下烘干后打粉，過60目篩，取629 g山香圓葉藥粉置于萃取釜中。具體操作條件為：萃取釜壓力為25 MPa(溫度45 ℃)；分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ壓力均為5 MPa；溫度分別為50 ℃、55 ℃，CO2流量為24 L/h；萃取時間為3 h。提取完成后于6 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，即得到山香圓葉的揮發(fā)油成分。

1.2 GC-MS分析

GC-MS條件：色譜柱為Rtx-5 MS(30 m×250 μm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度條件為270 ℃，分流比為20∶1，載氣為He(76 mL/min)壓力為57.4 kPa，程序升溫條件為：初始溫度為120 ℃，保留2 min；以15 ℃/min的速度升溫至180 ℃后再以10 ℃/min升至220 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升至224 ℃；以1 ℃/min升至232 ℃；以2 ℃/min升至240 ℃，保持1 min后再以3 ℃/min速度升至243 ℃；以1 ℃/min升至249 ℃；以3 ℃/min升至288 ℃；最后以1 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。EI離子源，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲時間5 min，掃描寬度為0～0.2 kV。

甲酯化前處理：稱取200 mg山香圓葉揮發(fā)油加入2 mL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，再加入10 mL正庚烷，在渦旋震蕩儀中混勻后靜置分層。取上清液過2.2 μm的微孔濾膜后再裝入進(jìn)樣瓶中以備GC-MS檢測。

甲酯化GC-MS條件：氣相色譜柱為Rtx-5 MS(30 m×250 μm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度條件為270 ℃，分流比為40∶1，載氣為He(76 mL/min)，柱流速為0.83 mL/min，平均線為33.9 cm/sec。程序升溫條件為：初始溫度為100 ℃，保留2 min后以10 ℃/min的速度升溫至205 ℃后再以3 ℃/min升至227 ℃，然后再以5 ℃/min升溫至265 ℃，最后以3 ℃/min升至300 ℃保持10 min。EI離子源，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲時間5 min，掃描寬度為0～0.2 kV。

1.3 LC-MS分析

LC-MS分析條件：色譜柱為BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1×100 mm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，采用多步線性梯度洗脫：0～3.5 min，95%→85% A；3.5～6 min，85%→70% A；6～6.5 min，70% A；6.5～12 min，70%→30% A；12～12.5 min，30% A；12.5～18 min，30%→0% A；18～25 min，0% A；25～26 min，0%→95% A；26～30 min，95% A。進(jìn)樣體積為5 μL；毛細(xì)管溫度：400 ℃；掃描質(zhì)量范圍為m/z100～1 500；鞘氣流速：45 Arb，輔助氣流速：15 Ar；Full ms分辨率：70 000，MS/MS分辨率：17 500；碰撞能量：15/30/45 V；噴涂電壓：4.0 kV(正)或-3.6 kV(負(fù))。

通過FullScan-ddMS2功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。將獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB(Metware Database)及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行篩選和鑒定。所有化合物的二級MS匹配率均在80%以上。

1.4 山香圓葉揮發(fā)油的抗氧化活性檢測

在藥物的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，常用DPPH法進(jìn)行中藥提取物抗氧化能力的檢測[10]，用ABTS法進(jìn)行植物源單體和粗體物的總抗氧化能力的檢測[11]。

準(zhǔn)確稱取山香圓葉揮發(fā)油100.00 mg樣品置于10 mL容量瓶中，用DMSO溶液定容至刻度線得到濃度為10 mg/mL的樣品溶液，再將其分別稀釋到6、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。

準(zhǔn)確稱取5 mg的DPPH試劑置于50 mL容量瓶中用DMSO定容至刻度線，將其混勻，在避光處保存。按照試劑盒說明書操作規(guī)程分別測定不同濃度樣品的清除DPPH和ABTS能力。

1.5 抗炎活性測定

將培養(yǎng)有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株RAW 264.7的高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用MTT法測定藥物對RAW 264.7細(xì)胞活性影響，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為空白對照組；模型組(加入終濃度為1 μg/mL的LPS)；DMSO組(0.2%)；DXMS組(50 μg/mL)；山香圓葉低、中、高劑量組(濃度分別為30、40、50 μg/mL)。同時，檢測其對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞的毒性。山香圓葉組各孔加入含有不同濃度(0、20、40、60、80、100、120、160 μg/mL)山香圓葉提取物完全培養(yǎng)液100 μL，孵育2 h后加入LPS使得終濃度為1 μg/mL，空白組與溶劑組加入等體積溶劑。藥物每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的MTT(0.5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入DMSO 0.15 mL，震蕩、混勻10 min后于酶標(biāo)儀490 nm波長下測吸光度，采用MTT檢測不同濃度藥物對細(xì)胞存活率的影響。

炎癥因子IL-6、NO含量檢測：用Griess法和ELISA檢測山香圓葉揮發(fā)油對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO和IL-6含量的影響，取小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為2×104個/mL，每孔200 μL，溫度37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)過夜后，棄培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，山香圓葉低、中、高劑量完全培養(yǎng)液每孔200 μL，設(shè)置4個復(fù)孔；孵育2 h后加入200 μL的LPS使得終濃度為1 μg/mL，空白組加入等體積無血清的DMEM，陽性藥物組加入50 μg/mL的DXMS，孵育24 h后收集各孔上清液在3 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液，用于炎癥因子的檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行繪圖，并用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取結(jié)果

采用SFE-CO2法提取得到棕黃色的山香圓葉揮發(fā)油，氣味清香。將其稱重為10.566 g，按公式：提取率=提取物質(zhì)量/樣品總質(zhì)量×100%，計(jì)算得其提取率為1.68%。

2.2 山香圓葉揮發(fā)油成分分析

2.2.1 GC-MS分析結(jié)果

山香圓葉揮發(fā)油直接進(jìn)樣的GC-MS總離子流圖見圖1a，主要鑒定得到38個化學(xué)成分，包括(-)-α-蒎烯、棕櫚酸、棕櫚酸乙酯等(見表1)，按照峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對百分含量，可得其中占比較大的為亞油酸、γ-谷甾醇、角鯊烯、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)，分別占15.09%、7.68%、7.35%和5.6%。甲酯化處理后的GC-MS分析共鑒定得到42個化合物(見表2)，主要包括月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸等，按照峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對百分含量，可得其中占比較大的為反-9-十八碳烯酸、亞油酸、棕櫚酸，分別占34.56%、10.08%和8.53%。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

表2 山香圓葉揮發(fā)油甲酯化后的GC-MS成分分析

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2.2 LC-MS分析結(jié)果

超臨界提取的油中除了揮發(fā)性的物質(zhì)以外，還包含了中等極性物質(zhì)。作為GC-MS的補(bǔ)充，LC-MS可有效地檢測這些物質(zhì)。從LC-MS正負(fù)離子模式下的離子流圖可得(見圖2)，油中存在大量的中等極性物質(zhì)，通過數(shù)據(jù)庫二級匹配，正離子模式下共鑒定出168個物質(zhì)(見表3)，負(fù)離子模式下共鑒定出106個物質(zhì)(見表4)。

表3 LC-MS正離子模式成分分析

續(xù)表3(Continued Tab.3)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

表4 LC-MS負(fù)離子模式成分分析表

續(xù)表4(Continued Tab.4)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

圖2 山香圓葉揮發(fā)油LC-MS正(a)、負(fù)(b)離子模式流圖

經(jīng)人工校對，去除18個重復(fù)的化合物，最終共鑒定出256個化合物，主要為萜類、苯丙素類、酚類、黃酮類、生物堿類、香豆素及其衍生物類、脂肪酰類、倍半萜類、脂肪酸類。

2.3 山香圓葉中揮發(fā)油的抗氧化活性

山香圓葉揮發(fā)油的抗氧化活性采用IC50表示，山香圓葉揮發(fā)油對DPPH自由基的IC50為3.56 mg/mL，在相同濃度范圍內(nèi)山香圓葉揮發(fā)油對ABTS自由基的抑制率則不足50%，因此，山香圓葉揮發(fā)油對DPPH的清除能力強(qiáng)于ABTS自由基，但對兩種自由基的清除能力均與濃度成正相關(guān)(見圖3、圖4)。

圖3 山香圓葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除能力(n = 3)

圖4 山香圓葉揮發(fā)油對ABTS自由基的清除能力(n = 3)

2.4 山香圓葉揮發(fā)油的抗炎活性

在評價藥物對細(xì)胞的活性之前，需要考察不同藥物濃度對細(xì)胞毒性的研究，本研究中山香圓葉揮發(fā)油濃度為20～80 μg /mL的組別中，細(xì)胞存活率與正常對照組比較無顯著性差異，但當(dāng)其濃度為100～160 μg/mL時均對細(xì)胞有顯著的毒性(P<0.01)，如圖5所示，因此，選擇20～80 μg /mL濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 MTT法測定藥物對RAW 264.7細(xì)胞活性影響

藥物對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO和IL-6分泌的影響結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，模型組的NO和IL-6釋放量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，山香圓葉高、中、低劑量組均能顯著抑制NO和IL-6的釋放量(P<0.01)，且隨著藥物劑量的增加，IL-6的抑制率也逐漸增加，NO的抑制率則先減少后增加，都在高劑量組顯示出最佳的抑制結(jié)果，表明山香圓葉揮發(fā)油可顯著抑制炎性因子釋放且一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖6 山香圓葉揮發(fā)油對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO和IL-6分泌的影響

3 討論與結(jié)論

化學(xué)成分顯著影響天然產(chǎn)物的活性和應(yīng)用前景。從GC-MS的分析結(jié)果可以得到亞油酸類及角鯊烯等為其主要的成分。亞油酸類具有較好的生物活性，能夠調(diào)節(jié)免疫功能，幫助糖原重新合成和增強(qiáng)骨鈣化，并可以增加脂肪成分的分解，減少脂肪的累積，進(jìn)而保護(hù)心血管系統(tǒng)[12-14]。類似的作用可見于(-)-α-蒎烯[15]。而且，(-)-α-蒎烯還具有抗菌作用和神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減少細(xì)菌性胃腸炎的感染以及減輕缺血性中風(fēng)時的神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡[16,17]。另外，角鯊烯作為山香圓葉揮發(fā)油中主要成分，具有廣泛的藥理作用，被廣泛應(yīng)用于保健品、美容產(chǎn)品及藥品的開發(fā)中，能增強(qiáng)機(jī)體組織氧的利用能力，抵抗機(jī)體因缺氧而引起的各種疾病，并提高人體耐力，改善心功能。具有保肝、保腎皮質(zhì)功能及抗腫瘤的作用。因此，山香圓葉揮發(fā)油具有廣泛保健品和藥品的開發(fā)前景。

另外，LC-MS鑒定到的揮發(fā)油中中小極性物質(zhì)中的萜類化合物被證明了在神經(jīng)保護(hù)方面具有重要作用[18,19]，苯丙素類化合物對神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默病以及相關(guān)的神經(jīng)炎癥也具有潛在的治療作用[20,21]。越來越多的研究表明揮發(fā)油的有效成分在神經(jīng)疾病方面具有一定的藥理作用，但這些有效成分的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探明，這也指明了揮發(fā)油在未來的研究方向。