異鉤藤堿調控ERK/p27Kip1信號通路改善博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化

陳 曉，李澤朋，何曉偉，李先偉*

1皖南醫學院藥學院藥理學教研室；2安徽省皖南植物藥活性物質篩選與再評價工程實驗室，蕪湖 241002

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種慢性間質性肺疾病，其特征是肺成纖維細胞異常增殖、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度積累、炎癥損傷和組織結構破壞，最終導致肺瘢痕形成、肺功能不全和呼吸衰竭[1]。氧化應激、炎癥反應、成纖維細胞增殖活化和ECM異常沉積等多種因素都參與了PF的發病機制，更重要的是肺成纖維細胞向肌成纖維細胞(myofibroblast，MFb)增殖分化的過程可能是肺纖維化形成的關鍵[2]。大量研究表明在轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等細胞因子的刺激下，肺成纖維細胞可大量增殖并分化為α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)陽性的MFb[3]。MFb通過其合成大量的ECM和促纖維化因子導致病理性肺組織重塑被認為是PF進展性的關鍵致病機制[4]。因此，探究肺成纖維細胞增殖和分化的機制并尋找其抑制靶點可能是減輕PF的潛在策略。

異鉤藤堿(isorhynchophylline，IRN)是從中藥鉤藤中分離出來的四環羥吲哚生物堿，前期研究發現IRN具有抗氧化、抗炎、抗增殖和神經保護等多種作用[5,6]。Guo等[7]研究發現IRN通過抑制肺動脈平滑肌細胞增殖并減輕肺血管重塑而緩解野百合堿誘導的肺動脈高壓。進一步研究發現，IRN通過抑制支氣管平滑肌細胞增殖而對支氣管哮喘具有一定的緩解作用[8]。最新的研究發現異鉤藤堿對二氧化硅誘導的小鼠肺損傷具有一定的保護作用[9]。而我們前期研究發現含羞草堿通過抑制細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)的磷酸化、上調p27Kip1的表達能夠明顯抑制TGF-β1誘導的肺成纖維化細胞的增殖分化[10,11]。而IRN通過抑制ERK1/2的磷酸化而明顯抑制血管緊張素II(angiotensin II，AngII)誘導的新生大鼠心室肌細胞的增殖[12]。基于以上的研究背景，本課題以ERK1/2、p27Kip1信號通路靶點，探究IRN抗PF的作用及機制，從而為研究開發具有抗PF作用的中藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠，體質量(18±2 g)，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.1.2 藥物與試劑

IRN(北京索萊寶科技有限公司，貨號II0310)；注射用鹽酸博萊霉素(Bleomycin，BLM)(浙江瀚暉制藥有限公司，批號H20055883)；SABC-AP免疫組化染色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司，批號KIT-5004)；Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG、DAPI染色液、細胞周期檢測試劑盒、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxy uridine，EdU)摻入細胞增殖檢測試劑盒、結晶紫染色液(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為A0428、C1005、C1052、C0085S、C0121)；Transwell小室(美國Corning公司)；重組小鼠TGFβ1(美國R&D公司，批號7666-MB)；PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTMII(北京寶日醫生物技術有限公司，批號分別為RR037Q、RR820Q)；改良Masson染色試劑盒、TGF-β1抗體、ERK1/2抗體、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體、I型膠原蛋白(collagen I)抗體及GAPDH抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為S0076、bs-0086R、bsm-33337M、bs-3016R、bs-7158R、bsm-33033M)；p27Kip1抗體、周期素依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)抗體和周期素E1(cyclin E1)抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為#3686、#18048、#4129)；波形蛋白(vimentin)抗體、α-SMA抗體(美國Santa Cruz公司，批號分別為sc-6260、sc-8432)；PVDF膜和ELC化學發光液(美國Merck Millipore公司，批號分別為IPVH00005、WBKlS0100)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、模型制備與給藥

C57BL/6J小鼠隨機分為正常(control，CON)組、BLM組、BLM+IRN低劑量(10 mg/kg)組和BLM+IRN高劑量(20 mg/kg)組，每組各12只。BLM(5 000 U/kg)氣管注射(藥物總量分兩次注射，每次間隔30 min)，制備肺纖維化模型。IRN用0.5%羧甲基纖維素鈉充分混勻，于造模后第三天連續灌胃給藥21天，CON組與BLM組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.2.2 肺組織病理檢測與膠原沉積分析

肺組織用4%多聚甲醛灌流后，參照我們前期實驗方法進行HE及Masson染色[10]，光鏡下觀察肺組織病理學變化及膠原沉積情況。根據文獻[13]以Ashcroft評分體系評價纖維化程度。此外，根據我們前期研究方法[14]，Masson染色結果以Image Pro Plus 6.0軟件測量并計算小鼠肺組織膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)：

CVF=(藍色膠原纖維面積/視野總面積)×100%

1.2.3 肺組織α-SMA免疫組化染色

肺組織用4%多聚甲醛灌流后，根據SABC-AP(鏈霉親和素-堿性磷酸酶)免疫組化法檢測肺組織α-SMA蛋白表達，α-SMA一抗濃度為1∶500。相應二抗濃度為1∶2 000。肺組織α-SMA蛋白陽性表達呈黃至棕黃色顆粒。

1.2.4 小鼠原代肺成纖維細胞培養及實驗分組

組織法分離C57BL/6J小鼠肺成纖維細胞，并用差時貼壁法進行純化，因成纖維細胞特異表達波形蛋白(vimentin)而上皮細胞波形蛋白表達比較低，經vimentin(1∶500)細胞免疫熒光染色鑒定后(鑒定結果見圖1)，取3～6代細胞用于后續實驗，具體培養方法詳見我們前期研究成果[11]。細胞實驗設對照(Control)組、TGF-β1 10 ng/mL劑量組、TGF-β1+IRN(5、10、20 μmol/L)劑量組。細胞先用TGF-β1預處理1 h，再加入IRN共孵育48 h。每組設2個復孔，實驗重復3次。

圖1 細胞免疫熒光檢測Vimentin的表達(×400)

1.2.5 EdU摻入法測定細胞增殖

細胞(4×104/well)接種于96孔板，按照細胞實驗方案處理細胞后，用BeyoClickTMEdU細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖情況。

1.2.6 流式細胞術測定細胞周期

細胞(1×106/well)接種于6孔板處理后，按照細胞實驗方案處理細胞后，收集肺成纖維細胞制成細胞懸液，細胞周期檢測試劑盒染色后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.7 Transwell細胞遷移實驗

細胞(2×105/well)接種于Transwell小室上室，按照細胞實驗方案處理細胞后，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，結晶紫染色液染色30 min，PBS洗滌后，顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

1.2.8 實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測相關基因表達

Trizol法提取肺組織和肺成纖維細胞總RNA，測定濃度后將其逆轉錄成cDNA。以2 μL cDNA為模板，20 μL反應體系，用StepOnePlusTMReal-Time PCR System進行PCR擴增。PCR反應條件參照我們前期的研究結果[10]。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 實時定量聚合酶鏈式反應引物序列

1.2.9 Western blot檢測相關蛋白表達

收集6孔板細胞，加入50 μL 0.1% PMSF的RIPA裂解液；稱取200 mg肺組織，液氮研磨后加入300 μL含0.1% PMSF的RIPA裂解液，吹打混勻，冰浴搖床裂解40 min。4°C、12 000 r/min離心10 min，吸取上清。BCA法測定蛋白濃度。參照我們前期的研究方法進行Western Blot檢測[10]。相關蛋白一抗濃度分別為TGF-β1(1∶1 000)、collagen I(1∶1 000)、α-SMA(1∶2 000)、p-ERK1/2(1∶2 000)、ERK1/2(1∶2 000)、p27Kip1(1∶1 000)、CDK2(1∶1 000)、Cyclin E1(1∶1 000)及GAPDH(1∶2 000)，相應二抗濃度(1∶2 000～1∶5 000)。用Image J 1.43軟件進行灰度值測量并統計分析蛋白相對表達量。

1.2.10 統計學方法

2 結果

2.1 IRN對PF小鼠肺組織病理學變化的影響

HE染色結果顯示CON組肺泡結構正常，未見炎癥反應，而BLM組肺泡結構出現萎縮和塌陷并發生融合，肺泡壁增寬增厚明顯，且可見大量炎性細胞的浸潤及分泌物，Ashcroft評分纖維化程度明顯升高(P<0.01)。而與BLM組相比，IRN低、高兩個劑量組給藥21天后，上述肺組織病理損傷均有不同程度的減輕，纖維化評分明顯降低(P<0.05)(見圖2、圖3)。

圖2 小鼠肺組織HE染色(×200)

圖3 肺組織纖維化評分及膠原容積分數

2.2 IRN對PF小鼠肺組織膠原及TGFβ1表達的影響

Masson染色結果顯示，CON組肺組織可見少量藍色膠原纖維，而BLM組肺組織可見大量藍色膠原纖維的沉積，CVF明顯升高(P<0.05)。而IRN低、高兩個劑量組給藥21天后，肺組織藍色膠原纖維染色明顯減少，CVF明顯降低(P<0.05)(見圖3、圖4)。另外，與CON組相比，BLM組collagen I、TGFβ1 mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與BLM組相比，IRN低、高劑量組TGFβ1、collagen I mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)(見圖5)。

圖4 小鼠肺組織Masson染色(×200)

圖5 異鉤藤堿對肺纖維化小鼠肺組織TGFβ1、I型膠原mRNA和蛋白表達的影響

2.3 IRN對PF小鼠肺組織α-SMA表達的影響

免疫組化結果發現，CON組肺組織α-SMA陽性表達水平較低，BLM組肺組織α-SMA陽性表達明顯增多，與BLM組相比，IRN低、高兩個劑量組α-SMA蛋白陽性表達均不同程度降低(見圖6)。另外，與CON組相比，BLM組α-SMA mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與BLM組相比，IRN低、高兩個劑量組α-SMA mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)(見圖7)。

圖6 免疫組化檢測肺組織α-SMA蛋白表達(×200)

圖7 異鉤藤堿對肺纖維化小鼠肺組織α-SMA mRNA和蛋白表達的影響

2.4 IRN對PF小鼠肺組織ERK1/2、p27Kip1信號通路相關蛋白表達的影響

Western blot檢測發現，與CON組相比，BLM組ERK1/2磷酸化水平明顯升高、周期素依賴性激酶抑制蛋白p27Kip1表達明顯下調、CDK2和Cyclin E1的表達明顯上調(P<0.01)。與BLM組相比，IRN低、高兩個劑量組ERK1/2磷酸化水平明顯降低、p27Kip1表達明顯上調、CDK2和Cyclin E1的表達明顯下調(P<0.05)(見圖8)。

圖8 異鉤藤堿對肺纖維化小鼠肺組織p-ERK1/2、p27Kip1、CDK2和Cyclin E1蛋白表達的影響

2.5 IRN對原代肺成纖維細胞增殖和遷移的影響

與CON組相比，TGF-β1能顯著誘導肺成纖維細胞增殖、明顯增加(S期+G2期)細胞周期比率(P<0.01)，而與TGF-β1組相比，IRN 5、10、20 μmol/L劑量組均不同程度地抑制肺成纖維細胞的增殖和降低細胞周期(S期+G2期)比率(P<0.05)(見圖9和圖10)。Transwell實驗檢測結果顯示，TGF-β1能顯著提高小鼠肺成纖維細胞的遷移能力，而與TGF-β1組相比，IRN 5、10、20 μmol/L劑量組均不同程度地降低肺成纖維細胞的遷移能力(見圖11)。

圖9 異鉤藤堿對TGF-β1誘導的小鼠肺成纖維細胞增殖和遷移的影響

圖10 流式細胞術檢測細胞周期

圖11 Transwell實驗觀察肺成纖維細胞遷移能力

2.6 IRN對TGF-β1誘導的小鼠肺成纖維細胞α-SMA和collagen I表達的影響

RT-qPCR和Western blot檢測發現，與Control組相比，TGF-β1能顯著上調肺成纖維細胞α-SMA和collagen I mRNA和蛋白表達(P<0.01)。而與TGF-β1組相比，IRN 5、10、20 μmol/L劑量組均不同程度地抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞α-SMA和collagen I mRNA和蛋白的表達(P<0.05)(見圖12)。

圖12 異鉤藤堿對TGF-β1誘導的小鼠肺成纖維細胞α-SMA和collagen I mRNA和蛋白表達的影響

2.7 IRN對TGF-β1誘導的小鼠肺成纖維細胞ERK1/2、p27Kip1信號通路相關蛋白表達影響

Western blot檢測發現，與Control組相比，TGF-β1能顯著升高肺成纖維細胞ERK1/2磷酸化水平、明顯下調p27Kip1蛋白表達而顯著上調CDK2和cyclin E1的蛋白表達(P<0.01)。而與TGF-β1組相比，IRN 5、10、20 μmol/L劑量組ERK1/2磷酸化水平不同程度降低、p27Kip1表達不同程度上調而CDK2和cyclin E1的表達不同程度下調(P<0.05)(見圖13)。

圖13 異鉤藤堿對TGF-β1誘導的小鼠肺成纖維細胞p-ERK1/2、p27Kip1、CDK2和Cyclin E1蛋白表達的影響

3 討論與結論

肺纖維化是一種進行性間質性疾病，其特征是成纖維細胞過度增殖和細胞外基質沉積，最終導致肺結構的破壞和纖維病灶的形成，預后較差[15]。目前，治療肺纖維化的藥物主要是糖皮質激素與免疫抑制劑，但其具有較嚴重的副作用。近年來，隨著對肺纖維化研究的不斷深入，利用中藥治療肺纖維化的探索與應用逐漸增多。中藥及其有效成分通過降低炎癥因子表達、抑制肺成纖維細胞增殖、誘導肺成纖維細胞凋亡、阻斷纖維化進程，表現出了良好的抗肺纖維化活性，并能夠有效改善纖維化癥狀并延緩病程進展[16,17]。前期研究發現生物堿類中藥單體如甲基蓮心見、氧化苦參堿等都具有一定的緩解肺纖維化的作用[18,19]。我們課題組前期研究還發現，含羞草堿和吳茱萸次堿對博萊霉素誘導的肺纖維化也有一定的緩解作用[10,20]。另有研究表明，中藥丹參素、丹酚酸B等通過抑制肺成纖維細胞增殖分化而改善了博萊霉素誘導的肺纖維化[21,22]。而前期研究發現IRN通過抑制PASMCs增殖并減輕肺血管重塑而緩解MCT誘導的PAH[7]，通過抑制支氣管平滑肌細胞增殖而對支氣管哮喘具有一定的緩解作用[8]。而本研究發現，給予IRN處理21天后，PF小鼠肺組織膠原沉積和collagen I的表達明顯減少、α-SMA的表達明顯降低、肺損傷程度明顯減輕。體外實驗進一步發現，IRN能夠明顯抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖、顯著降低TGF-β1誘導的細胞遷移，不同程度地抑制TGF-β1誘導肺成纖維細胞α-SMA和collagen I的表達。這些結果表明異鉤藤堿可能通過抑制肺成纖維化細胞增殖分化而改善了BLM誘導的肺纖維化。

研究表明肺成纖維細胞增殖、遷移和分化為MFb在肺纖維化發展過程中起著重要的作用[2]。其中，TGF-β1在成纖維細胞向MFb的增殖分化中起著關鍵作用。研究發現TGF-β1即可通過激活Smad信號通路促進肺成纖維細胞的增殖分化，也可通過激活MAPK信號通路誘導肺成纖維細胞的增殖分化[23]。周期素依賴性激酶抑制蛋白p27Kip1是CDK抑制蛋白Cip/Kip家族的成員，是蛋白激酶CDK2/cyclin E的負調節因子，可在G0/G1期阻斷細胞周期。p27Kip1在細胞周期的G0/G1期水平較高，在有絲分裂刺激下，p27Kip1迅速降解，從而允許CDK2/cyclin E的促進細胞增殖作用[24]。我們課題組前期研究發現，TGF-β1通過上調ERK1/2磷酸化水平、抑制p27Kip1的表達而誘導肺成纖維化細胞的增殖分化，而ERK1/2抑制劑PD98059通過抑制ERK1/2磷酸化、上調p27Kip1的表達而抑制TGF-β1誘導的肺成纖維化細胞增殖活化[11]。同時我們還發現，含羞草堿通過上調p27Kip1的表達而抑制了TGF-β1誘導的肺成纖維化細胞增殖活化[10]。而前期研究發現，IRN通過抑制ERK1/2的磷酸化、上調p27Kip1的表達而抑制了血小板活化因子誘導的PASMCs而緩解了MCT誘導的PAH[7]。進一步研究還發現，IRN通過抑制MAPK信號通路而抑制了心肌肥厚的發展[12]。本研究發現，IRN給藥3周后能夠明顯降低肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1的表達、抑制ERK1/2的磷酸化、上調p27Kip1的表達而下調CDK2/cyclin E1的表達。體外實驗進一步發現，IRN能夠明顯抑制TGF-β1誘導的ERK1/2磷酸化、顯著上調p27Kip1的表達而明顯下調CDK2/cyclin E1的表達。這些結果提示IRN可能通過調控ERK/p27Kip1而抑制肺成纖維化細胞的增殖分化。

綜上所述，我們的研究表明IRN可能通過抑制ERK信號通路、上調p27Kip1的表達而抑制了成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，從而減輕了BLM誘導的PF。本研究為IRN的臨床應用提供了新的理論依據，并為PF的治療提供了新的思路。