基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的不同年限陳皮入血成分分析

吳 蓓，申夢園，王 福，陳鴻平，劉友平，陳 林

成都中醫藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137

陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮[1]，自古認為產自廣東新會的陳皮質量較優。傳統上認為其有理氣健脾、燥濕化痰之功，用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[1]。陳皮主要含有黃酮、揮發油、生物堿、檸檬苦素等類化學成分[2]，現代藥理表明，其有降血脂[3]、抗氧化[4]等作用，并廣泛應用于臨床。

傳統中醫藥理論認為陳皮應陳化后使用。但是，對于陳皮具體陳化時間，歷代本草書籍說法不一，《藥鑒》載有“陳皮須用隔年陳”，又稱“陳皮必須年久者為美”[5]；《本草要略》云“陳皮隔年者方可用”；《日用本草》載：“陳皮多年者更妙”。即使是同一古籍，對于陳皮陳化時間尚未明確。現代對陳皮陳化年限的研究多從化學成分和藥效作用比較方面，且多從體外對不同陳化時間廣陳皮的化學成分進行研究。課題組前期已通過UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術對不同陳化時間的廣陳皮中黃酮類成分進行分析。大多數中藥仍通過口服給藥方式應用，通過分析口服給藥后血清中化學成分，確定中藥的體內直接作用物質，成為快速、準確研究及確定中藥藥效物質基礎的有效途徑[6]。目前，對廣陳皮體內成分鮮有報道。

本研究首次采用具有高分離度、高分辨率以及高靈敏度的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術，對不同年份廣陳皮進行入血成分比較研究，為廣陳皮藥效物質基礎及藥效學研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Q-Exactive型超高效液相色譜聯用儀(美國Thermo公司)；Agilent Extend-C18色譜柱(3.0 mm × 100 mm，1.8 μm)，十八烷基鍵合硅膠為填充劑(美國Agilent公司)；電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；ST18型臺式離心機(美國Thermo公司)；V76025型真空減壓干燥器(美國Thermo公司)。

1.2 材料

1.2.1 藥材及試劑

于廣東省江門市新會區三江鎮新馬單村，收集陳化2、4、8年(分別于2019、2017、2013年采集)的廣陳皮樣品(同一環境下貯存)各1批，經成都中醫藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定為蕓香科植物陳皮Citrusreticulate‘Chachi’的干燥果皮。經檢驗，藥材質量符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部中對陳皮的質量要求。對照品橙皮苷(批號為MUST-20031701，純度為98.46%)、川陳皮素(MUST-20041210，98.86%)、橘皮素(MUST-20072310，99.61%)購于成都曼思特生物科技有限公司；對羥基苯甲酸乙酯(批號為2020052601)購于成都市科隆化學品有限公司；水為超純水，甲醇、乙腈、乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2.2 動物

健康雄性SD大鼠，40只，SPF級，體質量(180±20)g，由四川成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK(川)2020-030。實驗方案經成都中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批同意，倫理審查批準號為2021-11。

1.3 方法

1.3.1 廣陳皮提取液的制備

分別稱取2、4、8年廣陳皮樣品各250 g，打碎置鍋中，加入10倍量水浸泡1 h，文火微沸煎煮30 min，濾過，藥渣加入8倍量水，文火微沸繼續煎煮30 min，再次濾過，合并兩次濾液，濃縮至0.4 g/mL，供灌胃用。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品橙皮苷、橘皮素、川陳皮素適量，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制成質量濃度為0.159、0.126、0.147 g/L的混合對照品溶液。

1.3.3 內標溶液的制備

準確稱取對羥基苯甲酸乙酯25 mg，加甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中。

1.3.4 供試品溶液的制備

取1.3.1項下廣陳皮提取液1 mL，至EP管中，稀釋十倍，在13 000 r/min離心10 min，取上清液，供LC-MS分析用。

1.3.5 動物給藥與血漿樣品采集

雄性SD大鼠飼養于成都中醫藥大學動物實驗房，室溫控制在20～25 ℃，適應性喂養1周，自由進食及飲水。連續灌胃3天，每天早晚各一次。末次給藥前禁食12 h，自由飲水。空白組給予生理鹽水。給藥組按0.4 g/mL劑量廣陳皮提取物灌胃給予大鼠，為盡可能多地檢測到含藥血漿中的成分，選取0.5、1、1.5、2、3、4 h總共6個時間點進行眼眶靜脈叢取血(左、右眼交叉取血約0.3 mL)，將血樣收集至裝有肝素鈉的EP管中，室溫靜置30 min，在3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，儲存在-20 ℃冰箱中，備用。

1.3.6 血漿樣品處理

取給藥后各時間點血漿樣品等體積混合，得到600 μL血漿樣本，加入3倍量甲醇，并加入100 μL內標溶液渦旋5 min后，在4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液至干凈EP管中，真空干燥至干，固體殘渣加100 μL甲醇復溶，渦旋5 min，在13 000 r/min離心10 min后，取上清液供LC-MS分析用。

1.3.7 色譜條件

Agilent Extend C18色譜柱(3.0 mm × 100 mm，1.8 μm)，流動相為0.5%乙酸水溶液(A)-0.5%乙酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，8%→15%B；10～20 min，15→20%B；20～30 min，20%→24%B；30～45 min，24%→64%B；45～60 min，64%→100%B)，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃。進樣量為5 μL。

1.3.8 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正、負離子切換模式掃描，掃描范圍為m/z100～1 500，Full MS一級分辨率為35 000，二級分辨率為17 500；正、負離子噴霧電壓分別為3.5和-3.0 kV；離子源溫度為350 ℃，鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb，離子傳輸管溫度為320 ℃。S狀透鏡電壓(S-Lens)為50 V，碰撞能量梯度為20、40、60 eV。

2 結果與分析

依據“1.3.7”項色譜條件及“1.3.8”項質譜條件進行分析，在正、負離子模式下采集給藥后血漿的色譜圖(見圖1～6)。

圖1 負離子模式下2年廣陳皮血漿 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖

利用Compound Discover 3.0軟件，將實驗所得數據的分子式和分子質量與mzcloud和mzvault數據庫進行匹配，設置一級及二級質量偏差5 ppm，匹配度分值大于80。分析大鼠灌胃廣陳皮藥液后的給藥血漿與空白血漿、廣陳皮提取液的差異，獲得入血成分。對于有對照品的化合物，通過與對照品比對保留時間、特征碎片離子來確定其結構及分子式，對于沒有對照品的化合物，根據文獻及碎片離子信息進行成分推測鑒定。結果，鑒定出2年陳皮入血原型成分和代謝產物分別為16個和18個；4年陳皮入血原型成分和代謝產物各為12個；8年廣陳皮入血原型成分和代謝產物分別為7個和8個(見表1)。

表1 2、4、8年廣陳皮入血成分

續表1(Continued Tab.1)

續表1(Continued Tab.1)

圖2 負離子模式下4年廣陳皮血漿 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖

圖3 負離子模式下8年廣陳皮血漿UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 的總離子流圖

圖4 正離子模式下2年廣陳皮血漿(a)、空白血漿樣品(b)及2年廣陳皮提取液(c)的總離子流圖

圖5 正離子模式下4年廣陳皮血漿(d)、空白血漿樣品(b)及4年廣陳皮提取液(e)的總離子流圖

2.1 黃酮苷元化合物鑒定

從大鼠的血漿中共鑒定出7個黃酮苷元，其中以川陳皮素為例做裂解規律分析。通過MS1圖譜確定其準分子離子峰為m/z403.138 9 [M+H]+，預測分子式為C20H20O8；MS2圖譜中，碎片離子為m/z313.960 2，主要是由母離子脫掉6個甲氧基團(C6H18，90)形成，碎片離子為m/z163.989 9和240.060 0，主要是由母離子斷裂1，2位和3，4位之間的共價鍵形成，碎片離子為m/z196.017 0，是由m/z240.060 0碎片離子脫去一個二氧化碳(CO2，44)形成，經過與文獻[8]比對，其質譜數據庫與川陳皮素一致，因此鑒定化合物31為川陳皮素，裂解規律如圖7所示。

圖6 正離子模式下8年廣陳皮血漿(f)、空白血漿樣品(b)及8年廣陳皮提取液(g)的總離子流圖

圖7 川陳皮素的裂解途徑

2.2 黃酮醇類化合物

黃酮醇化合物的裂解主要是特征的丟失CHO。通過MS1圖譜確定其準分子離子峰為m/z389.123 2 [M+H]+，預測分子式為C20H20O8；MS2圖譜中，碎片離子為m/z345.097 0，主要是由母離子脫去(CH3CHO，44)形成；碎片離子為m/z317.119 1，主要由碎片離子m/z345.097 0脫去一分子CO形成；碎片離子為m/z197.020 4和193.122 8主要由1，2位和3，4位共價鍵斷裂形成；碎片離子為m/z197.020 4也可能由碎片離子m/z345.097 0脫去碎片(C9H9O2149)形成。與文獻[18]數據對比，化合物25與艾黃素質譜數據一致，因此鑒定化合物25為艾黃素，裂解規律如圖8所示。

圖8 艾黃素的裂解途徑

2.3 不同陳化時間廣陳皮中黃酮類入血成分的相對含量比較

依據內標品峰面積，計算2、4、8年廣陳皮黃酮類入血成分相對含量，發現陳化2年廣陳皮黃酮類入血成分相對含量較陳化4、8年廣陳皮高(見表2)。

表2 不同陳化時間廣陳皮黃酮類入血成分的相對含量比較(n=3)

3 討論與結論

中藥陳用歷史悠久，陳皮為“六陳”之首，結合歷代本草著作和現代研究，陳皮的具體陳化時間問題尚未解決。課題組前期通過UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術對不同陳化時間的廣陳皮中黃酮類成分進行分析，從體外角度已證明“陳皮須用隔年陳”具有一定合理性。

本實驗基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS快速、精確的特點，固定采收時間、采樣地點、貯藏環境等條件，首次對不同年限廣陳皮進行入血成分比較分析，鑒定出陳化2年、4年和8年廣陳皮入血成分分別為34、24和15個。實驗發現，3個年份廣陳皮入血成分種類大致相同，依據峰面積比較相對含量，2年廣陳皮較其他兩個年份高，與前期體外實驗結果較一致，證明廣陳皮化學成分含量的差異會導致其入血成分含量的差異，可為“陳皮須用隔年陳”[18]的闡釋提供進一步依據。

陳皮主要成分為黃酮類化合物，陳皮中黃酮類化合物具有保護肝損傷[23,24]，降低血脂[25]等作用。川陳皮素是神經保護的代表性成分，可通過激活p-Akt、p-CREB、BDNF和Bcl-2通路及改善大鼠BBB通透性保護腦缺血[26]。橘皮素可以通過線粒體JNK/Baxpathway對心肌細胞產生抗凋亡作用[27]。異橙黃酮對HL-60、A549、HO8910和MCF-7四種癌癥細胞顯示出明顯的抗增殖作用[28]。艾黃素具有抗氧化、抗炎及抗病毒的作用[29]。結合陳皮傳統功效和現代藥理研究，初步推斷，川陳皮素、橘皮素等7個黃酮類成分可能是廣陳皮潛在的藥效物質基礎，后期仍需進行生物活性測定和藥效評價，并從中篩選能夠表達與中藥傳統臨床療效相關活性的成分作為藥效物質基礎。本實驗為陳皮的藥效物質基礎研究提供了一個新的有效的方法，后期可對不同年限廣陳皮入血成分進行比較研究，且結合藥效共同闡釋陳皮“陳久者良”科學內涵。

對于一些同分異構體，Compound Discoverer 3.0軟件只能從其碎片信息中提取到一些母核離子的具體信息進行結構上的推測，并不能對同分異構體進行區分，還需結合核磁共振技術對這些同分異構體進行結構鑒定[30]。