當歸揮發油改善阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶機制初探

王虎平

1甘肅中醫藥大學；2甘肅省方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，蘭州 730000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)作為一種以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的神經系統退行性疾病，由多種因素(包括生物和社會心理因素)共同作用誘發。其中神經遞質改變、氧化應激及β淀粉樣蛋白沉積等已成為明確誘因，且形成相互影響的級聯惡化反應，進一步促進、激發了AD的發生發展。

當歸作為“十大隴藥”、甘肅道地藥材，課題組在前期研究中已初步探明了其防治AD的作用[1，2]。為了推進當歸防治AD的有效組部位、組分的細化研究，課題組將遴選當歸的明確部位(組分)多糖、揮發油及阿魏酸進行有效組分及組分配伍研究，進一步優選防治AD的當歸核心部位或組分。本實驗基于神經遞質改變、氧化應激及β淀粉樣蛋白沉積等發病學說，研究當歸主要活性部位當歸揮發油防治AD的作用及其初步機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠70只，雌雄各半，3月齡，體重200±20 g，由中國農業科學院蘭州畜醫研究所實驗動物場提供，許可證號：SCXK(甘)2015-0001-62000600000198。

1.2 試劑與儀器

當歸揮發油(水蒸氣蒸餾法提取，藁本內酯含量40 %)由甘肅省輕工業科學研究所友情提供；Aβ25-35購于(上海強耀生物科技有限公司，批號：20160509)；Rat APP ELISA KIT(上海酶聯生物科技有限公司，批號：1069820)；Rat Aβ1-42ELISA KIT(上海酶聯生物科技有限公司，批號：1069821)；Rat Ach ELISA KIT(上海酶聯生物科技有限公司，批號：1069818)；Rat ChAT ELISA KIT(上海酶聯生物科技有限公司，批號：1069819)；AChE試劑盒(南京建成生物化學試劑有限公司，批號：20161218)；MDA試劑盒(南京建成生物化學試劑有限公司，批號：20161221)；SOD試劑盒(南京建成生物化學試劑有限公司，批號：20161221)；考馬斯亮藍蛋白測試盒(南京建成生物化學試劑有限公司，批號：20161220)；鹽酸多奈哌齊(安理申)(衛材(中國)藥業有限公司，批號：1604043)購于甘肅中醫藥大學附屬醫院；青霉素160萬單位(華北制藥股份有限公司，批號：F6057301)購于甘肅中醫藥大學附屬醫院。

Morris水迷宮視頻跟蹤系統(成都泰盟科技有限公司，型號：WMT-100)；酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司，型號：DNM-9602)；紫外分光光度計(日本島津，型號：UV-120-02)；數字恒溫水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司，型號：HH-S2)；臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備有限公司，型號：CT14RD)；HANGPING電子秤(上海精科公司天平儀器廠，型號：JY4001)。大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司，型號：WT-200)；牙科鉆(韓國世新公司，型號：STRONG-90)；微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)。

1.3 造模與給藥

實驗大鼠在SPF級實驗室適應性飼養3天后進行學習記憶能力篩選，剔除不合格大鼠。將合格的大鼠隨機選取10只(雌雄各半)為假手術組，其余大鼠全部以10 %水合氯醛(350 mg/kg)行腹腔注射麻醉，參考《大鼠腦立體定位圖譜》[3]在海馬CA1區注射已孵化好的Aβ25-35溶液(假手術組大鼠等位點注射同劑量生理鹽水)2 μL復制模型。假手術組及所有造模動物在手術后，皆用碘伏擦拭傷口并涂青霉素粉末100 000 U。30 ℃恒溫室內單籠留置至蘇醒后放回大籠，并每天肌肉注射青霉素100 000 U/只，連續7天。造模大鼠7天后進行水迷宮學習記憶能力測試，篩選造模成功的50只大鼠隨機分為模型組、陽性(安理申)組、當歸揮發油低、中、高劑量組等5組，每組10只。

精密量取當歸揮發油適量，以吐溫-80為乳化劑，分散于生理鹽水中，采用研磨法制成O/W型乳劑，作為供試藥物，其中當歸揮發油濃度分別為低劑量組0.002 2 mL/mL，中劑量組0.004 4 mL/mL，高劑量組0.008 8 mL/mL。精密稱取安理申在研缽中研為粉末，充分溶解于生理鹽水中，制成0.045 mg/mL的溶液，作為陽性藥物。精密量取生理鹽水，加入同比例吐溫-80乳化劑，制成生理鹽水混懸液，作為空白對照給藥。

造模第7天篩選分組后開始給藥。模型組與假手術組大鼠灌胃生理鹽水(吐溫-80)混懸液2 mL/100 g·d-1，當歸揮發油低(濃度0.002 2 mL/mL)、中(濃度0.004 4 mL/mL)、高劑量組(濃度0.008 8 mL/mL)及陽性組(濃度0.045 mg/mL)大鼠分別灌胃各組對應藥液2 mL/100 g·d-1，連續28天。

1.4 Morris水迷宮行為學測試

1.4.1 定位航行實驗

Morris水迷宮水池按方位分為四個象限，將逃生平臺放置在固定象限。測試時將大鼠面向池壁從四個象限各自的固定入水點放入水中，記錄其入水后尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如果大鼠在2 min內沒有找到平臺，則記為120 s。共歷時4天，每日更換入水象限進行測試。

1.4.2 空間探索實驗

Morris水迷宮實驗第5天撤走水下逃生平臺，任選1個象限入水點將大鼠放入水池，讓大鼠在無平臺情況下憑記憶尋找平臺位置。記錄大鼠入水后首次經過原平臺位置的潛伏期及120 s內跨越原平臺位置的次數及在原平臺象限的游泳時間百分比。

1.5 血清ACh、ChAT、AChE、SOD、MDA及海馬組織APP、Aβ1-42測定

空間探索實驗結束后，各組大鼠自由飲水、禁食12 h，然后腹主動脈取血，4 ℃、10 000 r/min離心3 min，取血清以ELISA法測定乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)含量及膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)活性、比色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，然后處死動物，迅速取出腦組織，分離海馬，加生理鹽水制成10%的勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，吸取上清液以ELISA法測定β淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)、β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein 1-42，Aβ1-42)含量。

1.6 統計學方法

用SPSS20.0統計軟件進行數據分析處理，數據以Mean±SD表示后，代入Graphpad Prism8.0軟件進行組間數據對比，采用獨立樣本t檢驗，制做圖形表現結果間的差異，P<0.05為差異有統計學意義；P<0.01為差異顯著。

2 結果

2.1 動物死亡情況

由于手術造模創傷較大，且每只動物每天灌胃給藥，實驗周期較長，各組出現了不同程度的動物死亡。其中模型組、假手術組各死亡2只，當歸揮發油低、中劑量組各死亡1只，陽性組死亡3只。

2.2 Morris水迷宮試驗測定學習記憶能力結果

2.2.1 對AD模型大鼠定位航行能力的影響

模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，目標象限滯留時間較少，與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；干預治療后當歸揮發油各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短，目標象限滯留時間均有不同程度增多，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)(見圖1、2)。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期

圖2 各組大鼠目標象限滯留時間百分比

2.2.2 對AD模型大鼠空間探索能力的影響

模型組大鼠首次到達原逃生平臺位置的潛伏時間明顯延長，穿越原平臺位置的次數、在目標象限滯留時間較少，與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；干預治療后當歸揮發油各劑量組大鼠首次到達原平臺位置的潛伏期明顯縮短，穿越原平臺位置的次數均有不同程度提升，在目標象限滯留時間均有不同程度增多，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)(見圖3、4、5)。

圖3 各組大鼠首次到達原平臺位置潛伏期

圖4 各組大鼠穿越原平臺位置次數

圖5 各組大鼠目標象限滯留時間百分比

2.3 對AD模型大鼠血清ACh含量與ChAT、AChE活性的影響

模型組大鼠血清ACh含量與ChAT活性明顯降低，AChE活性明顯增強，與假手術組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)；干預治療后當歸揮發油各劑量組大鼠血清ACh含量提高，ChAT活性增強，AChE活性減弱，與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)(見圖6～8)。

圖6 各組大鼠血清ACh水平

圖7 各組大鼠血清ChAT水平

圖8 各組大鼠血清AChE水平

2.4 對AD模型大鼠血清SOD活性、MDA水平的影響

模型組大鼠血清SOD活性顯著降低，MDA水平明顯增高，與假手術組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)；干預治療后當歸揮發油各劑量組大鼠血清SOD活性顯著增強，高劑量組大鼠MDA水平明顯降低，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)(見圖9、10)。

圖9 各組大鼠血清SOD活性

圖10 各組大鼠血清MDA水平

2.5 對AD模型大鼠海馬APP、Aβ1-42含量的影響

模型組大鼠海馬組織APP、Aβ1-42含量明顯增高，與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；干預治療后當歸揮發油各組大鼠海馬組織APP、Aβ1-42含量明顯降低，與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)(見圖11)。

圖11 各組大鼠APP、Aβ1-42蛋白含量

3 討論與結論

AD作為神經系統常見的一種退行性疾病，已躍居全球十大死因之列。中醫藥防治AD歷史久遠，文獻記錄豐富，且現代研究表明中醫藥治療AD具有明顯的療效和安全性。當歸甘補辛散而性情溫和，不僅能補血、活血，還可疏達肝氣、調暢氣機。如《景岳全書·本草正》指出：“當歸，其味甘而重，故專能補血；其氣輕而辛，故又能行血。補中有動，行中有補，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也。……大約佐之以補則補，故能養營養血，補氣生精，安五臟，強形體，益神志，凡有形虛損之病，無所不宜。”《藥鑒》云：“當歸氣溫，味辛甘，氣味俱輕，可升可降，陽也。多用，大益于血家，諸血證皆用之。但流通而無定，由其味帶辛甘而氣暢也，隨所引導而各至焉。入手少陰，以其心主血也；入足太陰，以其脾裹血也；入足厥陰，以其肝藏血也。”可見，當歸氣血同調，補虛通滯，是補血活血、調肝導滯之要藥，符合AD“痰瘀虛”三大病機。現代研究亦表明，當歸具有抗自由基氧化、抗衰老作用[4]，可緩解腦缺血后細胞的凋亡[5]，減輕癡呆小鼠記憶缺失[1]，顯示出對AD的潛在防治作用。當歸揮發油是其重要的藥效部位，含有苯酞類、酚類、萜烯類等化合物。已證實多類化合物具有保護神經、改善學習記憶的能力，如對苯酞類化合物中常見的藁本內酯的研究顯示，藁本內酯可通過促進清除Aβ沉積的途徑保護神經元[6]。Liu等[7]預測當歸揮發油質量標志物，認為當歸揮發油的核心靶點位于海馬、大腦皮層、基底節等區，且與神經保護、免疫調節相關。由于當歸揮發油中部分化合物不穩定，易發生異構化和降解反應[8]，為盡可能保證當歸揮發油的穩定性，極大程度還原其對腦神經的作用，本次實驗采用當歸揮發油灌胃的方式探究其對AD大鼠的作用。

本研究以海馬CA1區注射Aβ25-35溶液復制AD模型，從神經遞質改變、氧化應激及β淀粉樣蛋白沉積等角度探討了當歸揮發油對AD大鼠學習記憶的影響。結果顯示，當歸揮發油可顯著縮短模型大鼠逃避潛伏期，延長目標象限滯留時間，縮短首次到達原逃生平臺位置潛伏時間，增多跨原平臺次數，并可顯著提升血清ACh含量與ChAT、SOD活性，降低血清AChE活性、MDA水平及海馬APP、Aβ1-42含量，較好地改善了模型大鼠的學習記憶能力，表明其對AD具有一定的防治作用。

眾多研究表明，老年斑(senile plaques，SP)是AD的核心病理表現，由APP裂解為Aβ后進一步聚合而成。Aβ1-42與Aβ1-40是APP的裂解產物，其中Aβ1-42更容易聚集,具有較強的細胞毒性。當腦內Aβ1-42產生與清除機制的平衡遭到破壞，導致Aβ1-42在腦內過多堆積，呈現出彌散型斑塊即SP；Aβ1-42的聚積還可促使氧化應激、破壞機體膽堿能系統等進一步誘發或加速AD的發生發展。由于APP、Aβ尤其是Aβ1-42的大量堆砌將會激發多種機制、通過多種途徑促成AD的發生，因此APP、Aβ的含量測定成為衡量AD病情的指標之一。本研究表明當歸揮發油可降低APP、Aβ1-42含量，其中當歸揮發油與APP含量存在量效關系，當歸揮發油中劑量對Aβ1-42的抑制最強。當歸揮發油高劑量降低APP含量效果最佳，但此時Aβ1-42含量卻高于當歸揮發油低、中劑量組，在今后的研究中可進一步探索當歸揮發油抑制APP、Aβ1-42含量的最佳濃度、高劑量當歸揮發油是否在抑制APP表達的同時激活其他促進Aβ1-42產生的通路，以及降低APP含量是否存在有效范圍。

機體在自然衰老的過程中神經元會產生大量自由基[9]，自由基作用于脂質發生過氧化反應，形成具有細胞毒性的終極產物MAD，引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，亦能促進Aβ的毒性和聚集，促使AD老年斑的形成[10]。而膽堿能神經系統與大腦記憶的形成、貯存亦密切相關，直接影響著學習、記憶的能力[11]。其中乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)是促進學習記憶的重要神經遞質，廣泛分布于腦組織，由膽堿、乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成，在AChE的切割下分解。可見，ChAT和AchE的活性反映了ACh在腦中合成與代謝的速率，是維持Ach含量動態平衡的矛盾二體[12]。因此，ChAT催化活性的降低和AChE裂解活性的增強會引發乙酰膽堿的減少甚至缺失，必將導致機體認知功能下降，記憶能力喪失。本研究表明，當歸揮發油可顯著提升血清ACh含量與ChAT，降低血清AChE活性，其中中劑量當歸揮發油對ChAT的作用弱于低、高劑量組，但當歸揮發油與Ach水平存在量效關系。高劑量當歸揮發油提升SOD活性，降低MDA水平效果最佳。現從膽堿能神經遞質與氧化角度證實當歸揮發油對AD的作用，與此前用當歸水煎液干預AD模型小鼠的結果一致[1]，因此當歸揮發油可能是起效的主要成分之一。本實驗僅探討了當歸揮發油對AD的治療作用，其在體內外的吸收代謝規律及改善膽堿能神經遞質及提升抗自由基氧化能力等機制還需進一步探究。

綜上所述，當歸揮發油可有效改善AD模型大鼠學習記憶能力，其機制可能與促進Aβ的代謝、改善膽堿能神經遞質及提升抗自由基氧化能力等多通路及相互間級聯作用相關。