人參皂苷Rb1對MPTP誘導的神經元損傷和小鼠行為學異常的作用研究

耿藝娟，孫夢楨，趙進東，宋京風，胡煒彥*

1昆明醫科大學 藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室；2昆明醫科大學 生物醫學工程中心，昆明 650500

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)之后，影響中樞神經系統(central nervous system，CNS)的第二大常見神經退行性疾病。其主要病理學特征是多巴胺能神經元進行性死亡[1]，同時會出現酪氨酸羥化酶(TH)減少[2]；其主要臨床癥狀包括運動障礙(包括僵直，運動功能減退，靜止性震顫等)和非運動障礙(睡眠不足，記憶減退等)[3]。黑質多巴胺能神經元從背側紋狀體內的軸突末端以及中腦內的細胞體和樹突以鈣活性依賴的方式釋放多巴胺，它們在體內的產生和代謝是由不同離子通道的協調功能來調節的[4]，如鐵、鋅、銅、鈣都參與到了其中[5]。在全球大概每1 000萬60歲老年人中，就有1%的人患有此病，并且隨著全國人民生活水平的上升以及全球人口老齡化，帕金森癥的患病人數也在逐漸增加[6]。迄今為止，還沒有發現可以完全治療帕金森癥的方法，目前上市的治療藥物也僅僅只能改善帕金森病的癥狀卻不能完全治愈，這就使得帕金森病的治療研究成為一個亟待解決的問題[7]。

人參皂苷Rb1是人參、三七的主要活性成分[8]，人參具有安神、益智的作用[9]，三七對腦損傷具有保護作用，并且可以改善記憶[10]。人參皂苷Rb1可以改善大腦神經細胞缺氧凋亡、修復中樞神經系統損傷，具有很好的應用開發前景[11]。有研究表明，人參皂苷Rb1通過上調MPTP小鼠模型中的谷氨酸轉運蛋白GLT-1來改善運動功能障礙，預防DA神經元死亡[12]。而本文主要探討人參皂苷Rb1是否可以通過FP1、CaMKII以及抗凋亡蛋白Bcl-2來改善MPTP誘導的PD模型所造成的損傷，以期為帕金森的預防和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57B/L6雄性小鼠、C57B/L6孕18天的雌性小鼠(SPF)，購自昆明醫科大學實驗動物學部。合格證號：(SCXK(滇)-K2020-0006)。

1.2 藥物與試劑

人參皂苷Rb1(云南植物藥業有限公司，批號20171201，純度：98.5%)；MPTP(Sigma公司，貨號M0896)；神經元培養液(neurobasal medium，貨號12340817)、DMEM培養基(貨號11039021)、胰蛋白酶(Trypsin，貨號25200072)、磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號10010023)、青霉素-鏈霉素(P/S，貨號15070063)、胎牛血清(fatal bovine serum，FBS，Invitrogen公司)；Anti-Bcl-2(Abcam公司，貨號ab194583)；Anti-CaMKII(Abcam公司，貨號ab52476)；Anti-FP1(Invitrogen公司，貨號PA5-22993)；Anti-TH(Abcam公司，貨號ab137869)；Anti-β-actin(Thermo Fisher Scientific公司，貨號MA1-91399)。

1.3 原代小鼠多巴胺能神經元的培養

懷孕約18天的C57BL/6孕鼠經過脫臼處死后取出胎鼠，斷頭處理并在無菌操作下分離出胎鼠的中腦膜側組織，剪碎，用0.125%的Trypsin在37 ℃水浴中消化15 min，用含10% FBS的DMEM終止消化，75 μm篩網濾過，濾液離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清。加神經元培養液混懸，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清。加神經元培養液混懸，測細胞濃度，調整細胞濃度為5.5 × 105個/mL，接種于用0.01% PDL包被后的6孔板中。然后培養至第7天，給藥并通過顯微鏡觀察[13]。

1.4 實驗分組與給藥

分離出的神經元分為對照組(試劑空白組，C)、模型組(MPTP，10 μmol/L)，給藥組人參皂苷Rb1低劑量組(L，10 μmol/L)、人參皂苷Rb1中劑量組(M，20 μmol/L)、人參皂苷Rb1高劑量組(H，40 μmol/L)預處理30分鐘后給予MPTP(10 μmol/L)24小時。C57BL/6雄性小鼠分為對照組(試劑空白組，C)、模型組(MPTP，30 mg/kg)、人參皂苷Rb1低劑量組(L，10 mg/kg)、人參皂苷Rb1中劑量組(M，20 mg/kg)、人參皂苷Rb1高劑量組(H，40 mg/kg)。MPTP通過生理鹽水溶解后對C57BL/6雄性小鼠腹腔注射持續7天，MPTP通過DMSO溶解然后對神經元進行藥物治療；人參皂苷Rb1通過CMC-Na混懸然后對C57BL/6雄性小鼠灌胃給藥持續14天，人參皂苷Rb1通過DMSO溶解然后對神經元進行損傷。

1.5 曠場實驗

實驗用的曠場是方形的觀察區，長×寬×高：50 cm × 50 cm × 40 cm，主要用來研究動物在曠場的自主活動從而評價其運動能力。實驗在安靜的環境下進行，將動物放入箱內底面中心，同時進行攝像和計時。觀察5 min后停止攝像，75%酒精噴灑方箱內壁及底面，以免上次動物余留的信息(如動物的大、小便，氣味)影響下次測試結果。酒精揮發后更換動物，繼續實驗。根據計算機軟件統計小鼠在5 min內的運動距離。通過Prism進行數據統計。

1.6 爬桿實驗

小鼠的爬桿裝置包括底座、垂直長桿約80 cm且直徑1 cm，以及圓球。用來評價小鼠的運動抓握能力。實驗在安靜的環境下進行。將小鼠從圓球處放在長桿上讓其從桿子頂端走至桿子底端，同時進行攝像和計時。小鼠走到桿子端底時停止計時。75%酒精噴灑長桿，以免上次動物余留的信息(如動物的大、小便，氣味)影響下次測試結果。酒精揮發后更換動物，繼續實驗。根據計算機軟件統計小鼠從桿子頂端走至桿子底端的時間。通過Prism進行數據統計。

1.7 蛋白表達量檢測

將C57BL/6小鼠經過斷頭處理，分離出紋狀體，加入RIPA Buffer 100 μL，冰上裂解30 min后，13 200 r/min離心，取上清液，然后通過BCA蛋白測定試劑盒對蛋白進行定量，方法參照試劑盒說明書。定量結束后，將所有蛋白稀釋至同一濃度，然后將稀釋好的蛋白加入1× LDS Sample Buffer，95 ℃變性5 min，保持蛋白的穩定性。蛋白樣品通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%的牛奶封閉2 h，然后將膜與一抗(TH、CaMKII、FP1、Bcl-2)在4 ℃搖床下孵育過夜。將孵育后的膜在TBST中洗滌3次后，室溫下與熒光二抗孵育1 h。隨后，將膜用TBST再洗滌三遍，通過雙色紅外激光成像系統成像，使用Quantity-One定量蛋白質水平，通過Prism進行數據統計。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 人參皂苷Rb1對MPTP誘導的多巴胺能神經元的影響

與對照組相比，MPTP模型組的神經元明顯減少，軸突斷裂，碎片多。與MPTP模型組相比，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組都在一定程度上改善了MPTP誘導的神經元的損傷(見圖1)。

圖1 人參皂苷Rb1對MPTP誘導的小鼠多巴胺能神經元的影響

2.2 人參皂苷Rb1對MPTP誘導的PD小鼠運動能力的影響

曠場實驗是人們普遍認可的用于測量動物運動行為的經典實驗。我們首先用曠場實驗檢測了不同組別小鼠的運動行為。實驗結果顯示，與對照組相比，MPTP的小鼠模型組在曠場中的運動軌跡較少(見圖2A)；在曠場實驗中小鼠的運動距離顯著降低(見圖2B)。與MPTP模型組相比，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組都在一定程度上改善了MPTP誘導的PD小鼠在曠場中的運動能力(見圖2A、2B)。

圖2 人參皂苷Rb1對MPTP誘導的PD小鼠運動能力的影響

2.3 人參皂苷Rb1對MPTP誘導PD小鼠抓握能力的影響

爬桿實驗可以檢測小鼠的抓握能力及運動能力。實驗結果顯示，與對照組相比，MPTP模型組的小鼠在爬桿實驗中從桿子頂端到桿子底端的時間明顯增加。與MPTP模型組相比，在給予人參皂苷Rb1時，人參皂苷Rb1低、高劑量組都明顯降低了小鼠從桿子頂端到桿子底端的運動時間(見圖3)。

圖3 人參皂苷Rb1對MPTP誘導PD小鼠抓握能力的影響

2.4 人參皂苷Rb1對MPTP誘導PD小鼠相關蛋白的影響

MPTP會使鈣蛋白酶I和II激活，從而干擾正常細胞功能，導致細胞神經損傷。MPTP誘導的PD模型小鼠中鐵水平會增加，鐵轉運蛋白1(ferroportin-1，FP1)是一種新發現的鐵輸出蛋白，它的表達降低與鐵水平的增加息息相關。除此之外，MPTP處理的小鼠Bcl-2表達量會降低，Bcl-2在細胞凋亡和自噬是中起著關鍵性作用，它的失衡與帕金森病等神經退行性疾病有關。我們的研究結果表明，與對照組相比，MPTP模型組TH表達量表現出顯著性降低(見圖4A、4B)；CaMKII的表達量沒有顯著性差異(見圖4A、4C)；FP1的表達量表現出顯著性降低(見圖4A、4D)；Bcl-2的表達量顯著性降低(見圖4A、4E)。與MPTP模型組相比，人參皂苷Rb1中、高劑量組在TH的表達量中表現出顯著性升高(見圖4A、4B)；人參皂苷Rb1給藥組在CaMKII、FP1的表達量中沒有顯著性差異(見圖4A、4C、4D)；人參皂苷Rb1中劑量組在Bcl-2的表達量中表現出顯著性升高(見圖4A、4E)。

圖4 人參皂苷Rb1對MPTP誘導PD小鼠相關蛋白的影響

3 討論與結論

PD是世界上第二大神經退行性疾病，危害著人們的健康。PD中的神經化學異常是黑質中多巴胺能神經元的退化，導致紋狀體多巴胺(DA)水平降低，原代培養物是研究多巴胺能神經元特性和特征的最相關模型之一。可以將這些培養物置于模擬PD病理學的各種應激劑和神經保護化合物中，以阻止或減緩神經元退化[14]。因此我們通過體外培養多巴胺能神經元并通過MPTP損傷，觀察神經元的形態。此外PD所造成的運動損傷，以及TH酪氨酸陽性激酶的減少是其主要特征[15]。MPTP是一種神經毒素，并且是迄今為止研究帕金森病的“最佳”模型[16]。因此在本研究中通過我們曠場實驗與爬桿實驗檢測MPTP誘導的PD模型所產生的運動障礙，發現MPTP模型組表現出明顯的運動功能損傷，此外對MPTP誘導的小鼠模型的紋狀體蛋白進行檢測結果顯示MPTP模型組TH表達量表現出顯著性降低。

離子穩態在帕金森病中起著關鍵性作用。其中鈣、鐵穩態提及較多，且鈣、鐵穩態之間也相互影響，失調的鐵或鈣水平會促進鐵和鈣之間的有害串擾，從而導致神經元功能障礙和死亡[17]。Ca2+可能是協調復雜細胞器網絡來最終實現代謝相互作用、細胞內信號傳導、細胞維持和細胞存活調節的關鍵參與者，是細胞適應環境的基本元素，其穩態的破壞在MPP+毒性中起著至關重要的作用。MPTP會導致細胞內Ca2+升高，導致Ca2+依賴性酶的激活，例如蛋白激酶和鈣蛋白酶I和II，從而干擾正常細胞功能，導致細胞損傷[18]。在本研究中對MPTP損傷后CaMKII的表達量進行檢測，發現CaMKII的表達量沒有顯著性差異。鐵沉積是帕金森病(PD)病因學的關鍵因素之一。鐵穩態是通過鐵轉運蛋白和鐵儲存蛋白之間的相互作用來維持的。鐵運輸受損或鐵儲存改變可能會破壞鐵穩態平衡。有研究表明MPTP誘導的PD模型小鼠中鐵水平會增加。鐵轉運蛋白1(ferroportin-1，FP1)是一種新發現的鐵輸出蛋白，它在黑質中的表達降低可以解釋鐵水平的增加[19]。在本研究中對MPTP損傷后FP1的表達量進行檢測，發現FP1的表達量表現出顯著性降低。除此之外，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，有研究表明MPTP處理的小鼠Bcl-2表達量會降低，細胞凋亡和自噬是維持機體穩態和促進生存的重要細胞內過程[20]，它們的失衡與神經退行性疾病有關，例如PD，B細胞淋巴瘤Bcl-2家族成員參與維持自噬和凋亡之間的平衡，恢復自噬和細胞凋亡之間的平衡是治療PD的一種有前景的策略[21]。因此最后在本研究中我們還檢測了MPTP損傷后Bcl-2表達量，發現Bcl-2的表達量顯著性降低。

人參皂苷Rb1已被證實對幾種中樞神經系統疾病具有神經保護作用[22]。有研究通過免疫組化、免疫印跡、PCR、電生理等實驗發現Rb1改善了PD動物模型中的運動障礙，并且可以上調谷氨酸轉運蛋白GLT-1的來終止黑質紋狀體和皮質酮系統中的谷氨酸興奮性毒性。在一篇報道中，通過MPTP誘導PD模型小鼠，水迷宮、曠場實驗、電生理、免疫印跡、免疫熒光等方面檢測了人參皂苷Rb1通過調節α-突觸核蛋白/PSD-95途徑阻止MPTP誘導的海馬記憶變化[12]。而我們的研究主要針對MPTP誘導的多巴胺能神經元損傷及PD小鼠模型來探討人參皂苷Rb1對行為異常的改善作用及與抗凋亡蛋白Bcl-2之間的聯系。

我們的結果顯示人參皂苷Rb1可以恢復MPTP所造成的運動損傷，可以顯著改善MPTP所造成的TH酪氨酸陽性激酶的減少，這為帕金森的進一步治療以及中藥材活性成分的開發和使用提供了相關的方法。我們的研究還表明人參皂苷Rb1在抗凋亡蛋白Bcl-2方面表現出顯著性差異；人參皂苷Rb1雖然沒有對FP1以及CaMKII的表達量表現出顯著性差異，但MPTP確實造成了FP1表達量的減少，這可以為相關的研究提供一些想法，除此之外，人參皂苷Rb1在除了抗凋亡蛋白之外的其他機制還有待研究。