基于“免疫-炎癥”環節探究小柴胡湯“異病同治”系統性紅斑狼瘡和腎小球腎炎的作用機制

常夢麗，郭非非，唐仕歡，楊洪軍

中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700

辨證論治是中醫診療的特色和精髓，異病同治是中醫辨證論治方法的具體體現。運用現代科技手段揭示異病同治的生物學基礎及其作用原理是中醫現代化研究中的關鍵之一，也是進一步闡述辨證論治這一科學內涵的重要部分。小柴胡湯出自《傷寒雜病論》，由柴胡、黃芩、人參、半夏、生姜、甘草、大棗等七味藥組成，具有和解少陽的功效。中醫臨床隨證加減可廣泛用于多種疾病的治療，實現異病同治，如2型糖尿病、肺癌、亞急性甲狀腺炎及慢性乙型肝炎肝纖維化等[1-4]。此外，對感染性疾病如細菌性肝膿腫及小兒呼吸道感染也具有較好的臨床療效[5,6]。臨床報道表明，對免疫系統疾病患者如系統性紅斑狼瘡和腎小球腎炎患者，小柴胡湯能顯著改善其免疫指標，恢復正常免疫狀態[7,8]。現代藥理證實，小柴胡湯可通過調節免疫、抗炎、調節內分泌、抗肝纖維化及抗腫瘤等多個途徑作用于不同的疾病環節發揮藥效作用[9]。在這些作用環節中，小柴胡湯對免疫功能的調節和對炎癥反應的干預可能是其共性基礎[1,10,11]。

通過前期的研究，課題組已構建了基于網絡穩健性的中藥藥效預測平臺(http://47.92.232.154:100/)，該平臺可以實現模擬單味藥材、中藥復方及藥物靶點對疾病網絡的干預，具體實現過程是通過刪除疾病的網絡節點來模擬藥物對于疾病的擾動作用。刪除同一個疾病網絡不同的節點會導致網絡結構發生不同的變化，網絡的穩定性也不同，藥物對于疾病的干預目的在于最大限度影響網絡的穩定性和破壞網絡的結構。通過比較藥物干預前后網絡拓撲特征的變化使用擾動率來評價藥物對于疾病的干預作用。此外，通過構建隨機的網絡，模擬刪除節點對于隨機網絡穩健性影響的總體分布(permutation test)來考察藥物對于真實網絡擾動處于總體分布的位置，并通過計算校正后的擾動率來客觀評價藥物對于真實網絡的擾動強度[12,13]。以新型冠狀病毒肺炎為范例，該平臺已實現常用經典名方治療新型冠狀病毒肺炎的潛在作用分析，為新型冠狀病毒肺炎的有效藥物篩選提供了可靠參考[14]。

基于前期基礎，為探究小柴胡湯治療疾病的作用機制及具體環節，本研究以免疫系統疾病系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)和腎小球腎炎(glomerulonephritis，GN)為范例，基于基因表達綜合(gene expression omnibus，GEO)數據庫獲取SLE和GN疾病相關的差異基因構建疾病網絡，運用中藥藥效預測分析平臺分析小柴胡湯對兩種疾病的干預情況，并通過與上市西藥對疾病網絡的干預對比來驗證疾病模型的可靠性，隨后進行GO分析和KEGG分析，從“免疫-炎癥”的角度揭示小柴胡湯異病同治的機理。

1 方法

1.1 SLE與GN的疾病網絡構建

以疾病英文名即“systemic lupus erythematosus”與“glomerulonephritis”為關鍵詞在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)公共數據庫搜集SLE與GN疾病患者的基因表達譜數據，篩選條件如下：物種為人、每個ID須包含健康對照組、每組樣本數均≥3，取材部位一致，不包含小RNA的數據等。基于GEO2R工具在線分析得到差異基因，設置篩選條件為log2FC≥1或≤-1(差異表達上調或下調2倍以上)且P<0.01，最終將出現在2個以上GSE數據集中的基因作為所得差異基因的結果。將篩選得到的差異基因導入String(https://www.string-db.org)平臺構建差異基因可能的相互作用關系圖，并將此作用關系圖導入Cytoscape 3.8.0進行拓撲分析，以2倍degree中位數為條件篩選得到核心Hub網絡，以“degree”“closeness”和“betweenness”中位數為卡值篩選得到核心靶點，以此作為核心疾病基因上傳至中藥藥效預測平臺構建疾病網絡。

1.2 基于中藥藥效預測平臺的藥物擾動評分

基于中藥藥效預測平臺(http://47.92.232.154:100/)進行小柴胡湯對SLE與GN疾病網絡的擾動。具體操作如下：選擇輸入藥材進行靶標預測，輸入小柴胡湯藥材拼音名；選擇要干預的疾病網絡即SLE與GN疾病網絡；設定疾病網絡中蛋白質相互作用的卡值為0.5，設定分析參數p.adjust為0.5、富集比為3；點擊提交。

1.3 方法學驗證

基于文獻報道搜集臨床常用的用于治療SLE與GN的上市西藥，通過ChEMBL數據庫(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)獲得上市西藥的成分信息[15]，并搜集藥物的靶點，基于中藥藥效預測平臺進行上市西藥對疾病網絡的擾動。具體操作如下：選擇輸入藥物自定義靶標，輸入每個西藥的前250個靶點，選擇自定義網絡，手動輸入節點，輸入自定義網絡名稱以及自定義網絡中的節點即最終得到的疾病關鍵靶點；設定疾病網絡中蛋白質相互作用的卡值為0.5；設定分析參數p.adjust為0.5、富集比為3；點擊提交。利用z-Score模型將小柴胡湯對疾病的擾動評分進行校正，模擬與上市西藥的藥效對比。

1.4 GO功能富集分析與KEGG通路分析

利用metascape(http://metascape.org/gp/index.html)進行疾病網絡基因的生物學過程(biological process，BP)分析并將疾病網絡可視化，利用Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件，通過輸入小柴胡湯干預SLE與GN疾病的潛在靶點及共同靶點，設置物種為“homo sapiens”，閾值P≤0.05，進行GO分析和KEGG分析。

2 結果

2.1 SLE與GN疾病網絡可視化

基于GEO公共數據庫，按照上述步驟搜集、分析并篩選，最終到SLE患者的皮膚4個樣本數據集GSE148810、GSE109248、GSE95474、GSE81071，GN患者腎臟的12個疾病樣本數據集GSE116626、GSE115857、GSE133288、GSE108112、GSE108109、GSE104066、GSE113342、GSE93798、GSE32591、GSE35488、GSE35487、GSE104948。通過差異基因分析并選擇在至少2個研究ID內出現的基因，最終得到SLE相關的714個差異基因、GN相關的1 293個差異基因。通過蛋白互作分析及篩選得到SLE核心網絡的95個差異基因和GN核心網絡的112個差異基因，以此作為最終的疾病網絡基因上傳至中藥藥效預測平臺用于后續分析。利用metascape進行疾病基因的GO富集分析，發現SLE疾病網絡主要集中在先天性免疫應答的調節、適應性免疫應答、I型干擾素信號通路、淋巴細胞活化、白細胞遷移、B細胞增殖、參與免疫應答的白細胞活化、STAT級聯、B細胞增殖等生物學功能(見圖1)；GN疾病網絡主要集中在免疫效應過程的調節、細菌和病毒的應答、細胞因子的生成、白細胞的遷移和分化、細胞因子-細胞因子受體相互作用、ERK1和ERK2級聯反應、細胞死亡的正調節等生物學功能(見圖2)；且二者疾病網絡生物學功能均富集在對細菌的反應、白細胞遷移、對γ-干擾素的反應、細胞因子生成的調節等條目。

圖1 SLE疾病網絡中的節點參與的生物學功能

圖2 GN疾病網絡中的節點參與的生物學功能

2.2 上市西藥與小柴胡湯對疾病網絡的擾動評分

通過文獻檢索發現，臨床用于治療SLE的常用藥物按照藥理作用主要分為3類，分別是激素類、免疫抑制劑及抗瘧藥類[16-18]，本文選擇抗瘧藥氯喹，激素類藥物氫化可的松、可的松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、曲安奈德、倍他米松、地塞米松等，免疫抑制劑環磷酰胺、來氟米特、甲氨蝶呤、他克莫司、硫唑嘌呤等。臨床用于治療GN的常用藥物按照藥理作用主要分為6類，分別抗病毒藥類、激素類、免疫抑制劑類、利尿劑、降血壓藥類、抗凝藥類[19,20]。本文選擇抗病毒藥利巴韋林、青霉素G，激素類藥物潑尼松、潑尼松龍、甲基波尼松、地塞米松，免疫抑制劑環磷酰胺、他克莫司、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥，利尿劑甲苯喹唑磺胺、氯噻酮，降血壓藥纈沙坦，抗凝藥類華法林、阿司匹林等。基于中藥藥效預測平臺進行上市西藥對SLE、GN疾病網絡的擾動評分并按照擾動打分值進行排序(見表1、2)。小柴胡湯中，大棗和甘草作為佐使藥，其主要作用為調和藥性，且基于平臺算法，考慮到大棗和甘草會影響小柴胡湯對疾病網絡的擾動評分，并不能真實反映小柴胡湯中君藥、臣藥對疾病網絡的擾動情況，因此本文只分析小柴胡湯中除甘草、大棗外的藥材即柴胡、黃芩、人參、半夏、生姜、藥對(柴胡、黃芩)和組方(柴胡、黃芩、半夏、人參、生姜)對疾病網絡的擾動情況，且陽性藥的設置也可為小柴胡湯中的各個藥材對疾病網絡的擾動評分提供參考和對照。

表1 上市西藥對SLE疾病網絡的擾動評分

z值(z-Score)又稱標準分數(standard score)，用公式表示為：z=(x-μ)/σ(x為某實測值，μ為平均數，σ為標準差)。可將兩組或多組數據轉化為無單位的z-Score分值，使得數據標準統一化，將不同量級的數據轉化為統一量度的z-Score分值進行比較。z值代表實測值和總體平均值之間的距離，以標準差為單位計算，大于平均數的實測值會得到一個正數的z值，小于平均數的實測值會得到一個負數的z值。

以上市西藥對疾病網絡的擾動評分值為總體，小柴胡湯對疾病網絡的擾動評分為實測值，通過計算z-Score值進行比對。正數代表小柴胡湯對疾病網絡的擾動優于上市西藥，負數表示上市西藥對疾病網絡的擾動優于小柴胡湯。將小柴胡湯干預疾病網絡的數據按照擾動評分進行排序(見表3、4)。結果顯示，黃芩、柴胡、生姜單味藥材對SLE疾病網絡的擾動評分優于上市西藥，組方(柴胡、黃芩、半夏、人參、生姜)對SLE疾病網絡的擾動略差于上市西藥，黃芩、生姜、人參、柴胡、藥對(柴胡、黃芩)、組方(柴胡、黃芩、半夏、人參、生姜)、半夏對GN疾病網絡的擾動均優于上市西藥，綜合分析結果說明小柴胡湯具有異病同治SLE與GN的作用。

2.3 GO分析和KEGG分析

將小柴胡湯干預SLE疾病網絡的82個潛在靶點，小柴胡湯干預GN疾病網絡的77個潛在靶點分別導入Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件進行GO分析和KEGG分析，只保留滿足P<0.05的條目，結果如圖3、4、5、6所示，相同顏色代表同類的生物過程和信號通路，顯著性最高的結果用彩色顏色字體注釋，以上圖中只顯示具有顯著性意義的結果，小柴胡湯干預SLE與GN的靶點交集Venn圖如圖7所示。

圖3 小柴胡湯干預SLE疾病網絡的潛在靶點的GO分析

圖4 小柴胡湯干預SLE潛在靶點的KEGG分析

圖5 小柴胡湯干預GN疾病網絡的潛在靶點的GO分析

圖6 小柴胡湯干預GN潛在靶點的KEGG分析

圖7 小柴胡湯干預SLE與GN疾病潛在靶點的交集Venn圖

表2 上市西藥對GN疾病網絡的擾動評分

表3 小柴胡湯對SLE疾病網絡的擾動評分并經z-Score規范化

表4 小柴胡湯對GN疾病網絡的擾動評分并經z-Score規范化

GO分析結果顯示小柴胡湯治療SLE的作用機制可能與淋巴細胞增殖(lymphocyte proliferation)、適應性免疫應答的調節(regulation of adaptive immune response)、細胞因子生物合成過程(cytokine biosynthetic process)、白細胞增殖調節(regulation of leukocyte proliferation)、細胞因子受體活性(cytokine receptor activity)、I型干擾素信號通路(type I interferon signaling pathway)、病毒應答(response to virus)、先天性免疫應答(innate immune response)等生物過程相關，參與的主要信號通路主要是原發性免疫缺陷(primary immunodeficiency)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、Toll樣受體信號通路(toll-like receptor signaling pathway)、Th1和Th2細胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)、B細胞受體信號通路(B cell receptor signaling pathway)等與免疫系統及炎癥反應相關的信號通路。

小柴胡湯治療GN的作用機制可能與模式識別受體信號通路(pattern recognition receptor signaling pathway)、白細胞介導的免疫調節(regulation of leukocyte mediated immunity)、神經炎癥反應(neuroinflammatory response)、病毒應答(response to virus)、膠質細胞生成(glial cell development)、細胞因子分泌負調控(negative regulation of cytokine secretion)、ERK1和ERK2級聯調控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)等為代表的生物過程相關，其中以模式識別受體信號通路、白細胞介導的免疫調節等為例的免疫和炎癥反應相關的生物過程占比最高；參與的信號通路主要包括甲型流感(influenza A)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、胞質DNA感應通路(cytosolic DNA-sensing pathway)、軍團菌病(Legionellosis)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等。

小柴胡湯異病同治SLE與GN共有38個交集靶點，按照上述步驟對這38個靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析，結果如圖8、9所示，交集靶點見圖10交集靶點的生物過程和KEGG通路交集見表5。GO分析結果顯示小柴胡湯異病同治的作用機制可能與細胞因子生物合成過程的正調控(positive regulation of cytokine biosynthetic process)、α-干擾素生成的正調控(positive regulation of interferon-alpha production)、髓樣白細胞分化調節(regulation of myeloid leukocyte differentiation)、神經炎癥反應(neuroinflammatory response)、細胞因子受體活性(cytokine receptor activity)等生物過程相關，所參與的信號通路主要是胞質DNA感應通路(cytosolicDNA-sensing pathway)、人類對結核病的免疫反應(human immune response to tuberculosis)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、STAT3信號通路的調節回路(regulatory circuits of the STAT3 signaling pathway)、IL-3信號通路(IL-3 signaling pathway)等。

表5 SLE、GN、SLE與GN交集靶點三者分析的生物過程和KEGG通路交集

圖8 小柴胡湯異病同治SLE與GN交集靶點的GO分析

圖9 小柴胡湯異病同治SLE與GN交集靶點的KEGG分析

圖10 小柴胡湯干預SLE與GN的38個交集靶點

3 討論

SLE和GN均為免疫系統異常導致的疾病，基于GEO數據庫篩選發現SLE的靶器官眾多：皮膚、腎臟、呼吸系統、心血管、神經系統和胃腸道等且致病因素復雜。二者的發病機制均涉及遺傳、免疫系統的異常、炎癥反應等[19,21]。小柴胡湯干預SLE與GN及二者的交集靶點的GO分析和KEGG分析結果與免疫炎癥密切相關，如病毒過程的負調控、干擾素-β生成、對γ-干擾素的反應、細胞對γ-干擾素的反應、淋巴細胞增殖負調控、細胞因子生物合成過程的正調控、B細胞增殖調節、I型干擾素信號通路、干擾素γ介導的信號通路等生物過程，且可能是通過參與胞質DNA感應通路、NOD樣受體信號通路、B細胞受體信號通路等信號通路介導的。

SLE的GO分析和KEGG分析結果顯示小柴胡湯可能通過參與淋巴細胞增殖、適應性免疫應答的調節、細胞因子生物合成過程等生物過程發揮治療作用，而相關的信號通路包括同種異體移植物排斥、EB病毒感染、原發性免疫缺陷、Toll樣受體信號通路、Th1和Th2細胞分化等。同種異體移植物排斥會引起免疫系統的細胞免疫和體液免疫，主要免疫細胞是巨噬細胞，通過分泌炎癥效應因子，增強適應性免疫應答，參與急性和慢性排斥反應[22]。EB病毒是一種DNA病毒，其主要靶器官除了B細胞和上皮細胞外，還會感染T細胞、NK細胞和平滑肌細胞并具有致瘤的能力[23]。Toll樣受體信號通路在SLE的發病過程中發揮重要作用，研究表明，小鼠皮膚外用Toll樣受體7(TLR7)激動劑可誘導SLE疾病，出現腎小球腎炎等自身免疫性疾病導致的器官損害[24]。

GN的GO分析和KEGG分析結果顯示小柴胡湯可能通過參與模式識別受體信號通路、白細胞介導的免疫調節、白細胞增殖調節、神經炎癥反應等與免疫和炎癥相關的生物過程介導甲型流感、TNF信號通路、胞質DNA感應通路、軍團菌病(Legionellosis)、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路等信號通路實現治療。干擾素(IFN)信號通路是天然免疫的主要組成部分，在宿主抵抗病原體中發揮重要作用，臨床研究發現活躍性SLE患者血液中單核細胞與干擾素調節和粒細胞生成相關的特定基因高表達，可通過抑制IFN表達發揮緩解疾病進程的作用[25]。

數據分析顯示小柴胡湯異病同治SLE和GN可能是通過細胞因子生物合成過程的正調控、髓樣白細胞分化調節、對γ-干擾素的應答以及α-干擾素生成的正調節等生物過程發揮作用，與胞質DNA感應通路、NOD樣受體信號通路、人類對結核病的免疫反應、小膠質細胞病原體吞噬作用通路等免疫炎癥類的信號通路密切相關。其中，胞質DNA感應通路，哺乳動物細胞質中存在的DNA通過結合到一種名為cGAS的二聚體酶上，這種結合觸發一種酶促反應，導致一種環狀信號分子形成，進而會誘導被稱作干擾素的免疫刺激蛋白合成，因此觸發強大的先天免疫反應產生[26]，且胞質內不能及時清除的DNA會通過激活細胞內的抗病毒反應，參與SLE及Aicardi-Goutieres綜合征的發生[27]；NOD樣受體主要包括NOD1和NOD2，NOD1和NOD2通過其富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats，LRRs)識別細菌成分，并通過下游效應器介導NF-κB的激活，使促炎細胞因子釋放，在細胞的炎癥反應、免疫應答和應激反應等過程中起關鍵作用[28,29]。

本文分析結果中T/B細胞功能和信號、NF-κB信號通路和I型干擾素信號通路等與臨床研究中SLE及GN的潛在發病機制一致[30]，已獲得批準上市的治療SLE的藥物貝利木單抗(Belimumab)是B細胞激活因子(B-cell activating factor，BAFF)的抑制性單克隆抗體[31]，BAFF可促進B細胞成熟和分化，與自身免疫密切相關，在免疫應答中起重要作用。干擾素誘導的GTP結合蛋白MX1，它的靶標病毒包括負鏈RNA病毒和HBV[32]，臨床研究中MX1可作為診斷外周血SLE以及腎臟中狼瘡性腎炎活動的潛在標志物[33]。通過分析發現I型干擾素信號通路、病毒過程的負調控、對γ-干擾素的反應、干擾素γ介導的信號通路、淋巴細胞增殖負調控、干擾素-β生成(interferon-beta production)、B細胞增殖調節等生物過程和胞質DNA感應通路(cytosolic DNA-sensing pathway)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、甲型流感(influenza A)等信號通路均出現在小柴胡湯干預SLE、小柴胡湯干預GN、小柴胡湯干預SLE與GN的交集靶點的GO分析和KEGG分析結果中(見表5)，說明小柴胡湯異病同治的潛在機制可能與這些密切相關，未來仍需進一步深入研究。

本文仍存在不足之處，本文采用的中藥藥效平臺仍需進一步完善，目前還無法考慮到中藥靶點對于疾病靶點的作用強度問題，對于甘草、大棗等成分靶點較多的中藥，納入后會干擾方中主藥對疾病網絡的擾動結果，因此對疾病靶點的預測中去掉了甘草、大棗這兩味藥。

綜上所述，基于藥效預測分析和生物信息學方法，本文以小柴胡湯“異病同治”SLE和GN為范例，對柴胡類方異病同治的作用機理進行了系統分析，證實小柴胡湯可通過作用于“免疫-炎癥”相關的疾病環節發揮治療SLE和GN的作用，可為今后深入研究小柴胡湯“異病同治”的作用機制提供參考和借鑒，為解釋中藥復方在疾病中的干預環節和作用機制奠定基礎。