稀土離子對胰蛋白酶的影響

柳春霞，時鵬飛，劉建國

［齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010080］

1 概況

1.1 稀土概況

稀土離子又被稱為稀土元素，是典型的金屬元素，高純度的單一稀土金屬[1]。

1.2 稀土對微生物的影響

查詢資料表明[2-4]，一定濃度的稀土元素對微生物初期的生長具有輕微的刺激作用，但隨著周期增長，影響逐漸減小。

SchlyerB.D等[5]研究發(fā)現(xiàn)，稀土可將能量直接傳送給大腸桿菌堿性磷酸酶，促進細菌生長，稀土刺激細菌生長的主要作用機理可能是在細胞內(nèi)對某種作用的酶起激活劑作用。

1.3 胰蛋白酶

胰蛋白酶是動物胰臟的主要蛋白酶，為白色或米黃色結(jié)晶性粉末，分子量約為24 000，溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚，酶作用的最適pH因底物而不同，一般多在7～9[6]，pH 5易自溶失活，pH＞9.0不可逆失活。Ca2+對酶活性有穩(wěn)定作用。

2 稀土Nd3+對胰蛋白酶的影響

2.1 實驗方法

試劑試液：

A：酶液；B：0.1mol/L、pH 8.0硼酸鹽緩沖液；C：10mg/mL酪蛋白溶液；D：5%三氯乙酸；E：0.2mol/L鹽酸溶液。

取21支試管分別編號為0-9管；10-20管；對照管。

取試管0-9，加入1.0mLA，再加入2.0mLB，在水浴保溫10min，精確加入40℃預(yù)熱的5.0mLC，混勻，立即置于40℃水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，加入5.0（ml）D，迅速搖勻；

取第10-20號試管，加入1.0mLA，再加入2.0mLB，在水浴（40℃）保溫10min，精確加入5.0mLD，搖勻，在40℃水浴保溫30min后，再加5.0mlC，混勻。

取對照試管，分別加入5.0mlD和8.0mlA，混合。

將處理好的21支試管進行離心（3 500r/min）處理10min，并取上清液待用。

將對照試管的上清液作為對照，測定0～20號試管上清液在275nm處的光吸收值。

酪氨酸（Tyr）對照液以E作為對照，在275nm處測定吸收值（AS）。

2.2 實驗數(shù)據(jù)

2.2.1 活力測定

胰蛋白酶活力單位：

其中式（1）中，A：試管1的吸光值；

A0：試管2的吸光值；

As：酪氨酸對照液的吸光值；

C對照：Tyr濃度（μg/mL）；

M對照：181.19（Tyr分子量）；

V總：總體積，mL；

V樣：加入的樣液體積，mL；

t：反應(yīng)時間，min；

n：樣品的稀釋倍數(shù)。

2.2.2 實驗數(shù)據(jù)

（1）稀土離子濃度：1-8號管10-1～10-8g/mol，9號管，沒有加稀土離子 0號管稀土離子濃度為1g/mol，酶液濃度為 2×10-5g/mol

由圖1所示，可知稀土Nd對胰蛋白酶活性有一定的抑制作用。在10-2g/mol處，受到的抑制最小。

圖1 Nd對胰蛋白酶活性的影響

（2）稀土離子濃度：1-8號管10-1～10-8g/mol

9號管，沒有加稀土離子 0號管稀土離子濃度為1g/mol

濃度由原來的2×10-5g/mol變?yōu)闈舛葹?×10-4的酶液，以判斷稀土釹對胰蛋白酶的影響。且稀土離子增加了一組濃度為1g/mol的樣，來進一步驗證實驗。

如圖2所示，酶濃度為2×10-4g/mol在稀土釹離子的作用下，幾乎均對胰蛋白酶有促進的作用，其中在稀土離子的濃度為10-2g/mol 時，胰蛋白酶的活性最大，大約提高了28.4%的酶活力。在稀土離子的濃度為10-8g/mol時，亦為酶活性增加的一個極點。

圖2 Nd對胰蛋白酶活性的影響

（3）稀土離子濃度：稀土離子濃度：1-8號管10-1～10-8g/mol，9號管，沒有加稀土離子 0號管稀土離子濃度為1g/mol，酶液濃度為 2×10-5g/mol

在這次實驗中，如圖3所示，酶濃度為2×10-5g/mol在稀土釹離子的作用下，幾乎均對胰蛋白酶有抑制的作用，其中在稀土離子的濃度為10-7g/mol 時，胰蛋白酶的活性最大，大約降低了68.63%的酶活力。在稀土離子的濃度為10-6g/mol時，胰蛋白酶的活性值在所有加入稀土釹離子胰蛋白酶溶液中最大。

圖3 Nd對胰蛋白酶活性的影響

2.3 實驗結(jié)論

由以上實驗數(shù)據(jù)可知，實驗數(shù)據(jù)結(jié)論一致，即為稀土釹離子對于胰蛋白酶的活性有抑制的作用，使胰蛋白酶的活性降低。

3 紫外光譜分析

3.1 計算公式

摩爾消光系數(shù)ε與吸收度A的關(guān)系如下：

其中式（2）中C為所測樣品濃度，L為樣品池的厚度，A為吸收度。對已知樣品的ε，在一定L下，測得樣品溶液的A，即可求濃度C。

3.2 實驗藥品

胰蛋白酶、硼砂（Na2B4O7·10H2O）、硼酸（H3BO3）、氯化鈉、氯化釹溶液：濃度：1mol/L，10-1～10-8mol/L、0.1mol/L的氯化鈣溶液[取氯化鈣5.549g，加水500mL 使之溶解，用0.1mol/L 鹽酸滴定液或氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調(diào)節(jié) pH 至6.0～6.2]。

3.3 實驗方法

3.3.1 時間對稀土釹離子與胰蛋白酶相互作用的影響

在8mL胰蛋白酶溶液（濃度為1×10-4mol/L）中加入40μL的稀土釹離子溶液，（濃度為1.0×10-2mol/L），混勻，室溫條件下反應(yīng)10、20、30、60、90、120min，緩沖液為空白對照，測定溶液的紫外吸收。

3.3.2 不同濃度的稀土釹離子對胰蛋白酶的影響

按照稀土釹離子與胰蛋白酶的摩爾比[Nd3+]/[Try]=0∶1，0.2∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1的比例，將稀土釹離子溶液（1×10-2mol/L）分次加入3.0mL的胰蛋白酶溶液（濃度為1×10-4mol/L）中，搖勻，室溫條件下反應(yīng)15min，緩沖液為空白對照，測定溶液的紫外吸收。

硼酸鹽緩沖液的配制：取硼砂2.85g、硼酸10.5g 與氯化鈉2.50g，加水使溶解成1 000mL，調(diào)節(jié)pH至7.5 ±0.1

3.4 實驗結(jié)果

3.4.1 時間因素對稀土釹離子與胰蛋白酶的相互作用的影響結(jié)果

稀土釹離子濃度為1.0×10-2mol/L，胰蛋白酶液濃度為1×10-4mol/L，OD值為275nm處的紫外吸收值。

3.4.2 相同時間下不同濃度的離子對胰蛋白酶的數(shù)據(jù)不同濃度稀土釹離子在相同時間處理后胰蛋白酶的紫外吸收光譜見圖5。

圖5 不同濃度稀土釹離子在相同時間處理后胰蛋白酶的紫外吸收光譜

3.4.3 結(jié)果與討論

從圖4～圖5中可知稀土離子與胰蛋白酶作用的時間不同，對胰蛋白酶體系紫外吸收差譜未產(chǎn)生明顯的影響，說明稀土離子與胰蛋白酶在較短時間可能達到一個平衡，摩爾吸收系數(shù)相對穩(wěn)定。

圖4 稀土釹離子處理不同時間后胰蛋白酶的紫外吸收差譜

4 結(jié)論

以酪蛋白作為底物進行實驗，研究稀土釹離子對胰蛋白酶活性的影響。并應(yīng)用紫外光譜分析稀土對胰蛋白酶結(jié)構(gòu)的影響。依據(jù)實驗結(jié)果得出以下結(jié)論：

1）在胰蛋白酶濃度確定及反應(yīng)時間一定的條件下測定稀土離子Nd3+對胰蛋白酶活性的影響，得出稀土離子Nd3+對胰蛋白酶活性影響為抑制作用。

2）稀土釹離子濃度的逐步增加，胰蛋白酶在220nm附近的吸收峰也升高，并出現(xiàn)了輕微的紅移現(xiàn)象，可能是稀土釹離子影響了胰蛋白酶，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，造成了胰蛋白酶吸收系數(shù)的改變。