不同復(fù)合種養(yǎng)模式稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

宋宇 叢培東 曲貴偉 楊清海

（遼東學(xué)院，遼寧 丹東 118003；第一作者：763869365@qq.com）

土壤微生物不僅是土壤的重要組成部分，也是土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)力[1]。土壤微生物在調(diào)節(jié)土壤肥力、植物修復(fù)、碳氮等養(yǎng)分循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。土壤微生物多樣性可作為生態(tài)系統(tǒng)功能的敏感指標(biāo)，指示生態(tài)環(huán)境變化和生態(tài)系統(tǒng)功能變化[5]。據(jù)估計(jì)，在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的微生物僅占這些種群的一小部分（＜1%）。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)土壤微生物區(qū)系的研究也越來越深入，這為全面分析微生物群落的分類、系統(tǒng)發(fā)育和功能多樣性提供了可能[6-8]。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)利用化肥降低了病害率并提高了作物產(chǎn)量，使得化肥的貢獻(xiàn)率達(dá)到40%～60%[9-10]。但隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高度現(xiàn)代化和集約化發(fā)展，大量施用化肥后造成了土壤板結(jié)、土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)而降低了土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的驅(qū)動(dòng)力[11]。因此，減施化肥及尋求生物肥料代替化學(xué)肥料達(dá)到增長效力已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12-13]。李全勝等[14]通過增施微生物肥提高了玉米干物質(zhì)的積累，最終獲得高產(chǎn)。國外相關(guān)研究表明，通過在土壤中植入PGPR（生長促進(jìn)根桿菌）可增加作物根際區(qū)域微生物數(shù)量，促進(jìn)植物生長[15]。進(jìn)入21世紀(jì)，人們將魚、蝦、蟹和鴨等養(yǎng)殖生物引入稻田進(jìn)行復(fù)合種養(yǎng)生產(chǎn)綠色稻米，既保持了土壤肥力，又提高了產(chǎn)量，取得了良好效果[16-17]。目前國內(nèi)外對(duì)稻田復(fù)合種養(yǎng)模式的研究集中在水稻增長、病蟲害控制等方面[18-20]，對(duì)稻田土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)研究還較少。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)河蟹稻田（sdhxz）、非洲雁稻田（sdfyz）和龍蝦稻田（sdlxz）土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行比較分析，以為復(fù)合種養(yǎng)模式研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)，并為種養(yǎng)工藝的改進(jìn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA提取

土壤樣品采集于遼寧東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農(nóng)場(chǎng)。在水稻結(jié)穗期分別在河蟹、龍蝦和非洲雁三種復(fù)合種養(yǎng)稻田上隨機(jī)選5點(diǎn)，采集0～10.0 cm表層土壤，后將從5點(diǎn)采集的土樣混合為1個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3次。鮮土混勻裝入50 mL離心管后于-80℃冷凍保存用于多樣性分析。采用E.Z.N.A.SoilDNA試劑盒（OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.）對(duì)3種土壤樣品分別進(jìn)行總DNA提取。用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的總DNA濃度和質(zhì)量。

1.2 高通量16sr RNA焦磷酸測(cè)序

在基因文庫構(gòu)建中，細(xì)菌16 srRNA基因通過PCR擴(kuò)增，用于靶向超可變V3～V4區(qū)的引物。通用引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR程序如下：首先，95℃溫度下2 min作為初始變性，然后25個(gè)循環(huán)，變性、退火和延伸溫度及時(shí)間依次為95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)物的總體積為50μL，包括1×Pfx擴(kuò)增緩沖液、0.4 mM dNTP、2 mM MgSO4、0.4μM每對(duì)引物、DNA模板10 ng/μL 1μL和2 U鉑Pfx DNA聚合酶，使用TruSeq SBS試劑盒V3在Illumina Hiseq 300中對(duì)提取的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 細(xì)菌群落與生物多樣性分析

高通量測(cè)序后，對(duì)序列進(jìn)行聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個(gè)小組就是1個(gè)OUT，利用微生物生態(tài)學(xué)的定量研究（QIIME）對(duì)97%相似水平的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析[21]。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDPclassifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在門和屬水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成[22]。利用Mothur軟件進(jìn)行物種多樣性、豐富度及覆蓋度信息統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落多樣性和總體結(jié)構(gòu)差異

在對(duì)V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序后，9個(gè)樣本共獲得1171636個(gè)原始序列數(shù)，用QIIME“標(biāo)準(zhǔn)管-線”過濾低質(zhì)量讀數(shù)并修剪引物、適配器和條形碼后，如表1所示，三種模式稻田土壤分別獲得24 345～30 306個(gè)高質(zhì)量的有效序列數(shù)、2 168～2 540個(gè)OTU數(shù)。sdlxz的有效序列數(shù)和OTU數(shù)均高于sdhxz和sdfyz，說明sdlxz的物種數(shù)目要高于sdhxz和sdfyz。表1也展示了樣品的不同復(fù)合種養(yǎng)模式土壤的α多樣性指數(shù)變化情況。α多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有Chao、Ace、Shannon、Simpson等指數(shù)。其中，Chao和Ace指數(shù)用于分析群落物種的豐富程度，數(shù)值越大表示物種種類越多；Shannon和Simpson指數(shù)是反映群落的多樣性，不僅反映物種豐富度，還指示了物種的均勻度。Shannon數(shù)值越大，表示該樣品中的物種多樣性越高，而Simpson指數(shù)反之。sdhxz的Ace、Chao和Shannon指數(shù)均高于sdlxz和sdfyz，且sdhxz的Ace和Chao指數(shù)與sdfyz差異顯著。sdhxz的Simpson指數(shù)低于sdlxz和sdfyz，說明sdhxz中土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度均高于另外兩組稻田。

表1 16Sr RNA基因文庫97%相似性的OTU豐富度和多樣性指數(shù)比較

稀釋曲線是比較生態(tài)系統(tǒng)中物種多樣性常用的方法，本研究繪制了三種復(fù)合種養(yǎng)模式土壤組的稀釋曲線（圖1）。每組3次重復(fù)，共9條稀釋曲線。結(jié)果表明，這些樣品的稀釋曲線不接近漸近線，表明每個(gè)樣品都具有高度多樣性的微生物群落，進(jìn)一步測(cè)序?qū)⒃诿總€(gè)樣品中產(chǎn)生更多的OTUs。這些曲線表明sdlxz的OTUs高于另外兩組。

圖1 樣品稀釋曲線

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，可以比較直觀的展現(xiàn)不同環(huán)境樣本中物種組成相似性及重疊情況。圖2顯示，sdhxz、sdlxz和sdfyz的OUT數(shù)分別是2 540、2 570和2 168，三種稻田共有OTU數(shù)是1 638，sdhxz、sdlxz和sdfyz獨(dú)有的OTU數(shù)分別是111、119和332，說明sdlxz的物種數(shù)目最多，sdfyz的獨(dú)有物種數(shù)目最多。

圖2 物種Venn分析圖

β多樣性分析是通過不同微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行的組間比較分析，可探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。常用的分析方法有樣本層級(jí)聚類分析、PCA分析、PCoA分析和NMDS分析等。距離Heatmap圖可以呈現(xiàn)樣本層級(jí)聚類分析結(jié)果，該圖可通過顏色變化反映樣本間的距離變化大小。距離越大說明樣本特征值組成差異越大即2個(gè)樣本越不相似。從圖3可以看出，sdfyz與sdhxz和sdlxz的距離較遠(yuǎn)，說明非洲雁稻田的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和河蟹和龍蝦稻田有較大差異；sdhxz和sdlxz的距離較近，說明河蟹稻田和龍蝦稻田的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近。

圖3 稻田土壤細(xì)菌群落距離Heatmap圖

2.2 細(xì)菌群落組成的差異

圖4為門的平均相對(duì)豐度，分類序列為13個(gè)門，以變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、糖桿菌門（Saccharibacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Ignavibacteria）為主，占90%以上。圖4也顯示了三種復(fù)合種養(yǎng)模式稻田土壤細(xì)菌群落的主要門成分。sdhxz中擬桿菌門、酸桿菌門、儉菌總門（Parcubacteria）的豐度值分別為13.6%、6.9%和1.4%，均高于另外兩組。其中，儉菌總門只在sdhxz和sdlxz中有，而在sdfyz中未發(fā)現(xiàn)。sdlxz中變形菌門和藍(lán)藻菌門的豐度值分別為41.8%和7.0%，均高于sdfyz和sdhxz。sdfyz中綠彎菌門和放線菌門的豐度值則分別為15.1%和13.9%，高于sdhxz和sdlxz。厚壁菌門、綠菌門和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）在三種模式的稻田土壤中均有，但豐度較低。仍有許多序列在樣品土壤中豐富，但不能進(jìn)行分類，說明土壤仍然是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的生物多樣性庫。

圖4 三種模式下稻田土壤門水平的細(xì)菌組成豐度圖

屬級(jí)的深入分析研究顯示出土壤樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的富集趨勢(shì)。每個(gè)樣品中的任何一個(gè)屬的相對(duì)豐度均小于7%，表明3個(gè)樣品組的細(xì)菌多樣性均較高。如表2所示，所有土壤樣品中共獲得26個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌屬norank_f_Anaerolineaceae、norank_c_Cyanobacteria、norank_c_Bacteroidetes_VadinHA17、norank_p_Saccharibacteria和Pseudarthrobacter分別屬于變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻菌門和放線菌門。

2.3 細(xì)菌群落屬的比較

本研究在sdhxz、sdlxz和sdfyz中各自發(fā)現(xiàn)了一些獨(dú)特的屬。sdhxz中發(fā)現(xiàn)Nitrospira、Geobacter、norank_c_SBR2076和norank_c_OPB35等4個(gè)特殊屬；sdlxz有norank_f_Cytophagaceae特殊屬；sdfyz有Llumatobacter、Paenisporosarcina、norank_f_Nitrosomonadaceae、norank_f_Saprospiraceae和Triobacillus等5個(gè)特殊屬（表2）。norank_o_Sc_1_84、Sideroxydans、norank_f_Lentimicrobiaceae、norank_f_Gallionellaceae、Sulfuricurvum等5個(gè)屬在sdfyz中未發(fā)現(xiàn)，而存在于sdhxz、sdlxz中。norank_c_SJA_15、norank_f_Alcaligenaceae和norank_c_Acidobacteria則存在于sdhxz和sdfyz中。Pseudarthrobacter和norank_f_Xanthomonadales_Incertae_sedis則在sdlxz和sdfyz田中發(fā)現(xiàn)，而sdhxz沒有。

表2 三種模式下稻田土壤不同屬的分布

3 討論與結(jié)論

土壤是一個(gè)非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物在土壤中起著重要的作用。高通量測(cè)序是研究土壤微生物多樣性的良好方法，可用于土壤微生物群落DNA特異性片段的高質(zhì)量測(cè)序。本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，研究了稻田不同復(fù)合種養(yǎng)模式的土壤細(xì)菌群落的多樣性、組成和相對(duì)豐度。研究結(jié)果揭示了不同養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)微生物群落的影響。

對(duì)16SrRNA基因的V3~V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，共獲得1 171 636個(gè)原始序列和581 818個(gè)有效序列，然后在97%的相似度水平上聚類成3 101個(gè)OUT，可將細(xì)菌分為48門、115綱、223目、39科、71屬、1 335種。通過與數(shù)據(jù)庫的比較，發(fā)現(xiàn)三種復(fù)合種養(yǎng)模式的優(yōu)勢(shì)菌門相近，均為變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門，但各門在土壤樣品中的相對(duì)豐度有所不同，變形菌門在河蟹、龍蝦和非洲雁三種稻田的平均相對(duì)豐度分別為36.73%、41.82%和36.37%，擬桿菌門分別為15.62%、14.30%和13.32%，綠彎菌門分別為13.64%、9.42%和15.11%，放線菌門分別為6.87%、11.80%和13.92%，而酸桿菌門則分別為6.87%、11.80%和13.92%。Venn圖顯示，河蟹稻田、龍蝦稻田和非洲雁稻田的OTU數(shù)分別是2 540、2 570和2 168，三種稻田共有OTU數(shù)是1 638，河蟹稻田、龍蝦稻田和非洲雁稻田獨(dú)有的OTU數(shù)分別是111、119和332，說明龍蝦稻田的物種數(shù)目最多，非洲雁稻田的獨(dú)有物種數(shù)目最多。這些可能與土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分等因素有關(guān)。

變形菌門是三種復(fù)合種養(yǎng)模式土壤的優(yōu)勢(shì)菌門，研究證實(shí)，營養(yǎng)豐富的環(huán)境適合于該菌門的快速生長[23]。該細(xì)菌大多為革來氏陰性菌，其中許多細(xì)菌負(fù)責(zé)固氮和多環(huán)芳烴。根據(jù)以往的研究，無論作物品種還是土地管理實(shí)踐的不同，酸桿菌門都是相似的[24]。腸道內(nèi)的擬桿菌門數(shù)量在三種模式的土壤中占據(jù)細(xì)菌總數(shù)的1/4以上，說明其隨河蟹、龍蝦和非洲雁的排泄物排放到土壤中可作為肥料改良土壤。放線菌門廣泛存在土壤和水生態(tài)系統(tǒng)中，在分解和腐殖質(zhì)形成過程中起著關(guān)鍵作用[25]。綠彎菌門的主要營養(yǎng)方式是化能異養(yǎng)型，除此之外還包括化能自養(yǎng)、光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)及混合營養(yǎng)型。同一物種可隨外界條件的改變切換所需要的不同營養(yǎng)模式，因此使得綠彎菌門可以驅(qū)動(dòng)自身各種代謝與外界物質(zhì)交換來獲取和利用能源、碳源等參與了C、N、S等一系列重要生源元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[26]。三種復(fù)合種養(yǎng)模式稻田土壤測(cè)序共獲得26個(gè)屬，每種稻田都有獨(dú)有的屬類。河蟹稻田有4種獨(dú)有屬類，龍蝦稻田1種，非洲雁稻田則有5種。

國外研究證實(shí)，生物多樣性越高生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定[27]。本研究中，河蟹稻田和龍蝦稻田α多樣性相關(guān)指數(shù)都優(yōu)于非洲雁稻田，究其原因可能是河蟹和龍蝦是爬行動(dòng)物且具有尖銳的足，在稻田爬行過程中能很好的疏松土壤，增加土壤的通透性，利于更多微生物生長，而非洲雁是站立行走的動(dòng)物且鴨蹼扁平，在行走過程中減少了土壤的透氣性，限制了微生物的生長。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，河蟹稻田細(xì)菌群落的豐富度和多樣性均高于龍蝦稻田，說明在三種復(fù)合種養(yǎng)稻田中，河蟹稻田有更好的土壤細(xì)菌生態(tài)組成。