miR-146b在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系*

陶嘉楠,王學紅,馬臻棋,張宏琳

1.青海大學研究生院,青海西寧 810016;2.青海大學附屬醫院消化內科,青海西寧 810000

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一,早期癥狀隱匿,明確診斷時常常處于癌癥進展期,導致預后不佳。目前胃癌在全球常見癌癥中排名第五,是導致癌癥相關死亡的第三大原因[1]。我國是全球胃癌高發區,據世界衛生組織統計,2018年全球胃癌的發病例數已超103萬,我國約占44%,總死亡人數超過78萬,其中約一半為中國人[2]。胃癌的發生是一個復雜的過程,其發生機制尚不明確。近年來許多研究發現,微小RNA(miRNA)在胃癌的發生、發展中起著重要的作用[3],多種miRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平有明顯差別,其表達水平的上調或下調常常與胃癌的臨床病理特征有關[4-6]。miR-146b在腫瘤發生、發展中發揮著雙重作用,相關研究發現,miR-146b在惡性膠質瘤[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]、結直腸癌[11]等惡性腫瘤中發揮抑癌基因的作用,而在甲狀腺癌[12]中卻發揮著促癌基因的作用。本研究檢測胃癌患者miR-146b在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平,探討其在胃癌組織中的表達情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年11月至2021年9月在青海大學附屬醫院行胃鏡檢查并經病理檢查證實為胃癌的40例患者作為研究對象。納入標準：(1)經胃鏡和病理活檢首次確診為胃癌；(2)術前未經放化療、分子靶向治療、中醫藥抗癌治療等；(3)自愿參與該項研究,并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他臟器原發惡性腫瘤者；(2)肝、腎功能衰竭者；(3)近1個月使用抑酸藥、抗菌藥物者。在行胃鏡檢查時,用胃鏡活檢鉗鉗取癌組織及癌旁組織各1塊,其中癌旁組織取自距離癌組織邊緣大于5 cm的胃組織,立即放入凍存管內，并于-80 ℃冰箱保存。設計表格,記錄患者年齡、性別、內鏡下腫瘤最大徑、腫瘤部位、腫瘤分化程度、臨床分期等一般資料。40例患者中男33例,女7例；年齡33～74歲,中位年齡59歲；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期14例,Ⅲ～Ⅳ期26例,分期標準參照國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合會(UICC/AJCC)制定的TNM分期標準(第8版)。本研究經青海大學附屬醫院倫理委員會批準及監督。

1.2儀器與試劑 研磨儀(低溫型)、離心管、TIP頭均購自Servicebio公司；臺式高速冷凍型微量離心機購自DragonLab公司；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；超凈工作臺購自蘇凈安泰公司；超微量分光光度計購自Thermo公司；標準試劑型純水儀購自青島富勒姆科技有限公司；RNA提取液、逆轉錄試劑盒均購自Servicebio公司；miRNA通用引物和特異性引物由青海賽斯克生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1總RNA抽提 (1)取勻漿管,加入1 mL的RNA 提取液,置冰上預冷；(2)取100 mg組織,加入勻漿管中；(3)于勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊；(4)12 000 r/min離心10 min，取上清液；(5)加入250 μL三氯甲烷,顛倒離心管15 s,充分混勻,靜置3 min；(6)4 ℃ 下12 000 r/min離心10 min；(7)將400 μL上清轉移到一新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,顛倒混勻；(8)-20 ℃ 放置15 min；(9)4 ℃下12 000 r/min離心10 min,管底的白色沉淀即為RNA；(10)吸除液體,加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀；(11)4 ℃下12 000 r/min離心5 min；(12)將液體吸除干凈,將離心管置于超凈臺上吹3 min；(13)加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA；(14)55 ℃ 孵育5 min；(15)使用Nanodrop 2000檢測RNA質量濃度及純度：儀器空白調零后取2.5 μL待測RNA檢測吸光度值；(16)將RNA進行適當比例的稀釋,使其最終質量濃度為100～500 ng/μL。

1.3.2逆轉錄和實時熒光定量PCR檢測 從細胞中提取總RNA,用于逆轉錄反應,反應條件：25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 s。接著進行PCR擴增,反應條件：預變性95 ℃ 10 min,變性 95 ℃ 15 s,退火 60 ℃ 30 s,共40個循環。miR-146b正向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCAT-3′,反向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCCTAT-3′；內參基因U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用相對定量法(ΔΔCt法)計算各基因的相對表達量,表達倍數=2-ΔΔCt。在實驗過程中,為了減少誤差,將每個標本重復檢測3次后取平均Ct值作為最終值。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0進行數據統計分析,首先對數據進行正態性檢驗,結果發現本研究計量數據并不滿足正態分布,故采用M(P25,P75)表示。假設檢驗時,配對樣本比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗,兩獨立樣本比較采用Mann-WhiteyU檢驗,多組間比較采用Kruskall-WallisH檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1胃癌組織和配對癌旁組織中miR-146b相對表達水平比較 對40例胃癌組織和配對癌旁組織中miR-146b的表達水平進行熒光定量PCR檢測,結果顯示miR-146b在胃癌組織中的相對表達水平為0.690(0.463,1.135),低于配對癌旁組織中的1.115(0.683,1.593),差異有統計學意義(Z=-2.635,P=0.008)。

2.2胃癌組織中miR-146b的表達水平和臨床病理特征的關系 不同年齡、腫瘤分化程度、臨床分期和是否有淋巴結轉移胃癌患者胃癌組織miR-146b相對表達水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05),而不同性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑和是否有血行轉移胃癌患者胃癌組織miR-146b相對表達水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中miR-146b的表達水平和臨床病理特征的關系[M(P25,P75)]

續表1 胃癌組織中miR-146b的表達水平和臨床病理特征的關系[M(P25,P75)]

3 討 論

miR-146b是miR-146家族的成員之一,該家族包括miR-146a和miR-146b 2個成員,二者的結構很接近,區別僅僅在于3′-末端2個核苷酸序列不同,因此它們的作用相似[13],均發揮著轉錄后基因沉默子的作用,參與調節炎性反應和細胞周期調控。miR-146b由miR-146b基因編碼,該基因定位于人類第10號染色體[14],miR-146b前體約由73個核苷酸組成,并包含一個莖環狀結構,分別從其5′端臂和3′端臂加工為成熟的miR-146b-5p和miR-146b-3p[15]。miR-146b的作用機制十分復雜,目前仍不甚清楚,研究較為成熟的機制是miR-146b-表皮生長因子受體(EGFR)途徑,該途徑是在研究miR-146b與惡性膠質瘤發生的關系時發現。KATAKOWSKI等[16]研究發現,惡性膠質瘤患者10號染色體10q24-26區域經常缺失,而miR-146b基因恰好在這個區域內,所以導致了腫瘤細胞中miR-146b的表達水平明顯下降,并且還發現miR-146b與人膠質母細胞瘤細胞EGFR的mRNA 3′-非翻譯區(3′-UTR)結合,從而抑制了EGFR的表達,使得腫瘤增殖能力和侵襲性減弱。

張效通[17]研究發現,miR-146b在膀胱癌組織中低表達,并通過生物信息學研究發現，miR-146b可以與含半胱天冬酶募集結構域的膜相關鳥苷酸激酶蛋白3(CARMA3)mRNA的3′-UTR結合,抑制下游蛋白的表達,從而抑制膀胱癌增殖、侵襲、轉移,提示miR-146b在膀胱癌中發揮抑癌基因的作用。申翠蘋[18]研究發現,miR-146b可抑制宮頸癌細胞系Caski的增殖、侵襲和黏附能力,使細胞周期阻滯。閆美娜[19]研究發現,miR-146b可以明顯抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力,但是同時促進卵巢癌細胞增殖,增加了其對化療的敏感性。MITSUMURA等[20]發現,下調或消融小鼠體內miR-146b可引起小鼠造血系統惡性腫瘤,可能機制是miR-146b通過抑制激活核因子-κB的表達,從而導致炎癥和腫瘤的發生。鄭建[21]研究顯示,miR-146b在早期和中晚期甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中均呈明顯高表達,同時隨著腫瘤分期的增加,其表達水平有升高的趨勢,提示其在PTC中發揮著促癌基因的作用。因此,miR-146b不是單純發揮著促癌或抑癌作用,在不同的惡性腫瘤中其作用不同，甚至完全相反。在大多數惡性腫瘤中miR-146b發揮抑癌基因的作用,在少數惡性腫瘤(如甲狀腺乳頭狀癌等)中發揮促癌基因的作用。本研究結果發現,miR-146b在胃癌組織中表達下調,推測其發揮抑癌基因的作用。

miR-146b作用的下游重要靶點之一是EGFR。LIU等[22]研究了miR-146b是否能致敏對EGFR的靶向藥物即酪氨酸激酶抑制劑(TKI)耐藥的肺癌細胞,結果發現miR-146b異位表達增強的肺癌細胞發生了TKI誘導的細胞凋亡,推測miR-146b可能是克服TKI耐藥的有用工具,這也從側面反映了miR-146b在肺癌中亦通過作用于EGFR發揮抑癌作用。CHOU等[23]研究發現,miR-146b的異常表達與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的侵襲性和預后相關,推測miR-146b的關鍵作用是作為一種致癌監管分子,監測細胞轉化及腫瘤復發。

本研究結果發現,不同年齡、腫瘤分化程度、臨床分期和是否有淋巴結轉移患者胃癌組織miR-146b的表達水平比較,差異有統計學意義(P<0.05)。miR-146b通過復雜的細胞信號網絡來調控下游的分子,其參與胃癌發生、發展的機制十分復雜,需要進行大量的生物信息學分析及基礎研究才有可能逐步解析其作用機制。本研究的局限性在于研究對象均為青藏高原世居者,受海拔和高原低氧的影響,研究結果的代表性可能不強,無法排除低氧對miR-146b表達的影響,仍需多地區、多中心、大樣本量的研究,以消除地域因素的影響,使得試驗結果更具代表性,以便為胃癌的診斷與治療提供新的方法。