lncRNA DILC在精神分裂癥患者外周血單核細胞中的表達及其與炎癥因子的相關性分析*

陳秋瑩，殷海波，夏雯瑩，周 錦，舒 銘

1.上海市浦東精神衛生中心檢驗科，上海 200123；2.上海健康醫學院周浦醫院檢驗科，上海 201318

精神分裂癥是一種高致殘率、高復發率的嚴重精神疾病，影響了全球1%的人口[1]，其核心癥狀包括陽性癥狀、陰性癥狀和認知功能障礙。研究發現，精神分裂癥是基因與環境共同作用的結果，但具體病理生理機制不明[2]。目前，精神分裂癥患者的診斷主要依賴于臨床精神科醫生依據患者及家屬的主訴和患者的異常行為做出經驗性診斷，尚無客觀的診斷方法。同時，精神分裂癥患者治療也主要依賴醫生的主觀判斷及量表評估。因此，迫切需要客觀有效地診斷精神分裂癥的生物標志物，以及提供了新的治療靶點。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 bp，不具有編碼蛋白能力的RNA[3]。研究發現，lncRNA可通過改變染色質結構、調控表觀遺傳、調節轉錄前和轉錄后等多種方式干擾基因的轉錄和蛋白質的表達[4-6]。精神分裂癥相關的全基因組關聯分析(GWAS)結果顯示，大量單核苷酸多態性(SNP)的位點位于lncRNA區域[7]；轉錄組學研究也顯示，精神分裂癥患者的外周及中樞神經均有 lncRNA 表達譜的改變[8]；上述研究說明lncRNA與精神分裂癥密切相關。有研究證明，炎癥在精神分裂癥的病理過程中起重要作用[9]，在精神分裂癥患者血液中也發現了免疫標志物的變化，如C反應蛋白(CRP)或各種白細胞介素[10]。此外，圍生期感染與晚年精神分裂癥發生有關[11]。流行病學研究表明，精神分裂癥風險的增加與嚴重感染或自身免疫性疾病存在聯系[12]。有研究發現，肝癌干細胞下調lncRNA(lncRNA DILC)通過抑制白細胞介素-6(IL-6)的轉錄和STAT3的激活來抑制肝癌干細胞的擴張[13],也就是說，lncRNA DILC可以通過炎癥通路來調控肝癌的發生。目前，關于lncRNA DILC與精神分裂癥的關系的研究較少，本文探索lncRNA DILC在首次發作未經抗精神病藥物治療的精神分裂癥患者外周血單核細胞中的表達，同時分析lncRNA DILC與炎癥因子CRP、IL-6，以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的相關性，探索其可能的病理機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2020年12月在上海浦東精神衛生中心就診的76例精神分裂癥患者作為精神分裂癥組，另選取76例體檢健康者作為對照組。精神分裂癥組納入標準：(1)依據國際疾病分類第10版(ICD-10)精神分裂癥診斷標準，由2名副主任職稱及以上職稱的精神科醫生進行診斷；(2)首次發作，未曾服用過抗精神病藥物；(3)無藥物濫用史。排除標準：(1)其他精神疾病；(2)其他嚴重的軀體疾病，如癌癥、血液系統疾病等。對照組納入標準：3代之內親屬無精神疾病患者。精神分裂癥組男44例，女32例；平均年齡(28.48±3.22)歲；平均體質量指數(22.36±1.46)kg/m2；有吸煙史21例，無吸煙史55例。對照組男39例，女37例；平均年齡(29.61±1.82)歲；平均體質量指數(23.01±1.27)kg/m2；有吸煙史18例，無吸煙史58例。兩組性別、年齡、體質量指數及吸煙史比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液標本采集 分別采集所有受試者清晨空腹靜脈血2管，一管為肝素抗凝管，另一管為乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，各5 mL，3 500 r/min 離心 10 min。肝素管保留上清，-80 ℃ 保存備用。EDTA管用淋巴細胞分離液(P8670，北京索萊寶科技有限公司)分離單核細胞，將分離出來的單核細胞用 4 ℃預冷的 D-Hanks 緩沖液(H1045，北京索萊寶科技有限公司)沖洗 2次，離心沉淀后加入 1 mL 細胞裂解液TRIzol(WE0213A，上海聯邁生物工程有限公司)，置于冰上反復輕輕吹打細胞至混勻，-80 ℃ 保存備用。

1.2.2檢測方法 使用實時熒光定量PCR儀(SLAN-96p，上海創賽科技有限公司)檢測單核細胞中lncRNA DILC的表達。檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。用 TRIzol試劑和逆轉錄試劑盒(WD3126，美國 Life Technologies公司)提取總RNA，隨后逆轉錄為cDNA。引物均由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計并提供。DILC：上游引物為5′-CGCACAGAGCAAAGCCATTT-3′，下游引物為5′-GCAAGGGGCTAGAAGAAGGG-3′；內參β-action：上游引物為5′-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3′，下游引物為5′-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3′。PCR反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，共40個循環。用2-ΔΔCt法計算lncRNA DILC的相對表達量。CRP測定使用QickRead比濁儀及其配套試劑(Aidian Oy奧瑞雅診斷有限公司，批號：KN75/K011)，IL-6和TNF-α使用IMMULITE 1000化學發光分析儀及其相應試劑盒(西門子醫學診斷有限公司，批號分別為：20210506、0382)測定。

1.2.3陽性和陰性精神癥狀評定量表(PANSS)評分 采用PANSS評分判斷疾病的嚴重程度，共30個基本條目，組成3個分量表：陽性、陰性和一般精神病理量表。陽性和陰性量表每個條目均為7級評分，一般精神病理量表為16級評分，按精神病理水平遞增排列。PANSS評分越高表示癥狀越嚴重。由2名副主任醫師職稱的精神科醫生獨立做出評估，且評估結果一致。

2 結 果

2.1兩組外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達量、炎癥因子水平及PANSS評分比較 精神分裂癥組外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達水平,CRP、IL-6、TNF-α水平及PANSS評分明顯高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達量、炎癥因子水平及PANSS評分比較

2.2lncRNA DILC對首發精神分裂癥患者的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，lncRNA DILC對首發精神分裂癥患者有較高的診斷效能，曲線下面積(AUC)為0.899(95%CI：0.839～0.960，P<0.001)，靈敏度為97.4%，特異度80.3%，cut-off值為1.41。

2.3lncRNA DILC表達水平與炎癥因子的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，首發精神分裂癥患者外周血單核細胞lncRNA DILC相對表達水平與CRP、IL-6、TNF-α及PANSS評分均呈正相關(r=0.861、0.877、0.915、0.901，均P<0.001)。見圖1。

圖1 lncRNA DILC與CRP、IL-6、TNF-α及PANSS相關性散點圖

3 討 論

目前，精神分裂癥病理生理機制尚不明確，研究者們在不斷地探索中提出了幾種假說，如神經遞質假說、神經炎癥假說、易感-應激-炎癥模型等假說，這些假說中均有炎癥的參與。其中，易感-應激-炎癥模型假說表明精神分裂癥是神經炎癥、激活的小膠質細胞、多巴胺能、5-羥色胺能、去甲腎上腺素能和谷氨酸神經遞質相互作用的結果[14]。有研究認為，免疫系統、免疫過程和炎癥因子在精神分裂癥的神經生物學中具有重要作用[15]。DERRIEN等[16]將人類的 lncRNA 表達數據進行聚類分析發現，約40%表達于腦部。MERCER等[17]通過原位雜交技術發現，大部分腦表達lncRNA具有神經解剖區域、細胞類型或亞細胞特異性，說明中樞神經系統正常功能的執行與lncRNA 密切相關。精神分裂癥是一種神經系統疾病，已有研究報道lncRNA與精神分裂癥的相關，如MAIT rs1894720在中國漢族偏執型精神分裂癥患者中明顯表達，但由于具體機制不明確，限制了MAIT在臨床中的使用[18]。通過抑制人類神經母細胞中及小鼠神經細胞中的lncRNA HOTAIRM1表達發現，多巴胺神經元的標志物酪氨酸羥化酶(TH)及代謝物囊泡單胺轉運體(VMAT2)減少，從而說明HOTAIRM1影響了多巴胺神經元的分化、成熟和代謝，但谷氨酸神經遞質沒有變化[19]。大量研究發現，lncRNA DILC通過調控炎癥通路，如STAT3和(或)NF-κB通路參與了肝癌、膽囊癌、膀胱癌等的發生[13,20-21]。同時有研究發現，lncRNA DILC在骨關節炎中呈低表達，并調控軟骨細胞中炎癥因子的表達[22]。可見lncRNA DILC通過調控炎癥通路參與了許多疾病的發生和進程，但鮮見與精神分裂癥相關性的報道。

從本研究中可發現，精神分裂癥組外周血單核細胞lncRNA DILC的相對表達量明顯高于對照組(P<0.001)，精神分裂癥組炎癥因子CRP、IL-6和TNF-α與對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.001)，這與前期國內外的研究結果一致[23-24]。ROC曲線分析顯示，lncRNA DILC對首發精神分裂癥患者有良好的診斷效能，AUC為0.899(95%CI：0.839～0.960，P<0.001)，靈敏度為97.4%，特異度80.3%；Pearson相關分析表明，lncRNA DILC與炎癥因子CRP、IL-6、TNF-α及PANSS均呈明顯正相關(P<0.001)。

綜上所述，lncRNA DILC可作為精神分裂癥診斷的潛在生物標志物，并且與首發精神分裂癥患者病情的嚴重程度明顯相關，其可能通過調控炎癥因子參與精神分裂癥的病理過程。然而，本研究樣本量較小，可能會影響本研究的信度，有待下一步增大樣本量驗證lncRNA DILC在精神分裂癥病理機制中的作用，為精神分裂癥的診斷和療效判斷提供可靠的生物標志物。