血漿外泌體A1BG-AS1對原發性肝癌診斷及預后評估價值*

曾雅莉，唐 靜

華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院檢驗科,湖北武漢 430077

原發性肝癌(PHC)是臨床常見的惡性腫瘤，主要發生在肝細胞或膽管細胞，其主要病理類型為肝細胞癌(HCC)，其患病率在我國惡性腫瘤位列第四位，死亡率居第三位，嚴重威脅患者生命健康[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與肝癌細胞的增殖、侵襲、轉移等過程，外泌體是直徑40～100 nm的小囊泡，內含蛋白質、miRNA、lncRNA等，可參與調節細胞信號傳導，其中外泌體lncRNA可參與基因調控、細胞增殖等，同時也參與肝癌的發生、發展[2]。郭靜等[3]研究表明，高表達lncRNA H19的外泌體可明顯促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。A1BG反義RNA 1(A1BG-AS1)為lncRNA的一種，已有研究顯示，A1BG-AS1在HCC組織明顯低表達，與微血管侵犯、腫瘤分級高、腫瘤分期晚期和患者預后不良有關，過表達A1BG-AS1可明顯抑制HCC細胞的增殖、遷移與侵襲[4]。但是關于A1BG-AS1在肝癌患者血漿外泌體中表達及意義的報道較少。本研究通過檢測PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1水平變化，探討A1BG-AS1與患者臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年12月至2018年6月在本院進行治療的75例PHC患者作為PHC組。其中男43例，女32例；年齡37～73歲，平均(55.60±8.70)歲。收集PHC患者腫瘤大小、腫瘤分期、肝功能分級、淋巴結轉移、肝硬化及甲胎蛋白(AFP)水平等臨床病理特征資料。納入標準：(1)符合《原發性肝癌診治規范(2011)》標準[5]；(2)病理診斷為HCC；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤或轉移性肝癌；(2)合并心、肺、腎等嚴重基礎疾??；(3)失訪及未按規定定期隨訪。選取單純肝硬化患者26例作為肝硬化組，均符合肝硬化診斷標準[6]，其中男15例，女11例；年齡37～75歲，平均(56.4±8.90)歲。選取50例同期體檢健康者作為對照組，其中男29例，女21例；年齡38～76歲，平均(56.1±8.50)歲。各組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意，并自愿簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 ExoQuick exosome提取試劑盒購自美國System Biosciences公司，熱休克蛋白70(HSP70)抗體和CD63抗體購自Abcam公司，RNA提取試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；逆轉錄試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix Kit購自TaKaRa公司；JEM-2100透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社，ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.3方法

1.3.1血漿外泌體提取與鑒定 所有入組人員抽取靜脈血6 mL，裝入含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管后，3 000 r/min，離心10 min，收集血漿，使用ExoQuick exosome提取試劑盒提取外泌體，使用2%磷鎢酸染色后用透射電子顯微觀察，蛋白質印跡法檢測外泌體標志蛋白HSP70和CD63表達。

1.3.2血漿外泌體A1BG-AS1檢測 采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血漿外泌體A1BG-AS1相對表達量。RNA提取試劑盒(Thermo Fisher Scientific)提取血清外泌體總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA后，使用SYBR Green PCR Master Mix Kit(TaKaRa)進行RT-qPCR擴增。A1BG-AS1上游引物序列為5′-CTTACTGGGCAGCATTG-3′，下游引物序列為5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算血漿外泌體A1BG-AS1相對表達量。

1.3.3隨訪 PHC患者治療后，對所有患者進行隨訪，統計患者生存情況，隨訪日期截至2021年6月30日，總隨訪時間為36個月，所有患者完成隨訪，隨訪率為100%。

2 結 果

2.1血漿外泌體的鑒定 透射電鏡觀察提取的血漿外泌體，可見30～100 nm大小圓形或橢圓形囊泡，外泌體可特異性表達HSP70、CD63。見圖1。

注：A為透射電鏡下血漿外泌體形態，放大倍數為50 000倍；B為Western blotting檢測外泌體標志蛋白HSP70和CD63表達。

2.2PHC組、肝硬化組、對照組血漿外泌體A1BG-AS1表達水平比較 對照組、肝硬化組、PHC組血漿外泌體A1BG-AS1表達水平分別為1.13±0.24、0.75±0.18、0.43±0.11，3組間比較差異有統計學意義(F=240.812，P<0.01)；兩兩比較顯示，肝硬化組、PHC組血漿外泌體A1BG-AS1表達水平明顯低于對照組(P<0.01)，PHC組血漿外泌體A1BG-AS1表達水平明顯低于肝硬化組(P<0.01)。

2.3血漿外泌體A1BG-AS1、AFP單獨和聯合檢測對PHC的診斷價值 ROC曲線分析顯示，血漿外泌體A1BG-AS1單獨檢測診斷PHC的曲線下面積(AUC)為0.842(95%CI：0.774～0.896)，約登指數為0.722，截斷值為0.61，靈敏度為89.33%，特異度為82.89%；AFP單獨檢測診斷PHC的AUC為0.829(95%CI：0.759～0.885)，約登指數為0.523，截斷值為208.62 ng/mL，靈敏度為76.00%，特異度為76.32%；A1BG-AS1、AFP聯合檢測診斷PHC的AUC為0.898(95%CI：0.839～0.941)，約登指數為0.657，靈敏度為90.67%，特異度為75.00%。見圖2。

圖2 血漿外泌體A1BG-AS1、AFP單獨和聯合檢測診斷PHC的ROC曲線

2.4PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達水平與臨床病理特征關系 根據PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達水平的均值，將PHC患者分為高表達組(38例)和低表達組(37例)，χ2檢驗顯示，不同腫瘤分期、肝功能分級和有無淋巴結轉移PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達情況差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達水平與臨床病理特征關系

2.5PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1水平與預后關系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，A1BG-AS1高表達PHC患者的3年生存率明顯高于A1BG-AS1低表達PHC患者，差異有統計學意義(χ2=6.857，P=0.009)。見圖3。

圖3 不同血漿外泌體A1BG-AS1表達水平的PHC患者生存曲線

2.6影響PHC患者預后的危險因素分析 Cox回歸模型單因素分析結果顯示，腫瘤分期為T3～T4、有淋巴結轉移、A1BG-AS1低表達是影響PHC患者預后的危險因素(P<0.05)；多因素分析結果顯示，腫瘤分期為T3～T4、有淋巴結轉移、A1BG-AS1低表達是影響PHC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響PHC患者預后的危險因素分析結果

3 討 論

PHC是臨床常見惡性腫瘤之一，因其有生長活躍、侵襲性強等特點，早期易發生轉移，術后易復發，進而影響患者生存。血清AFP是診斷肝癌的標志物，但是靈敏度不高，因此，尋找其他腫瘤標志物，以及對肝癌患者進行早期篩查和預后判斷對肝癌患者的治療有重要意義[7]。

細胞在正常狀態與病理條件下均可分泌外泌體，外泌體中含有蛋白質、lncRNA等，可在細胞間進行信息傳遞，并影響靶細胞中的信號通路，進而參與機體的病理生理過程。lncRNA是一類非編碼RNA，通過調控相關基因表達參與細胞周期、細胞遷移等多種生理過程，有研究報道，多種lncRNA與肝癌復發、診斷、預后、疾病進展和耐藥性有關[8]。lncRNA可通過調節腫瘤血管生成、免疫系統活性、上皮間質轉化及競爭性內源miRNA等多種機制參與肝癌的發生、發展及轉移。吳鋒等[9]研究顯示，lncRNA ZFAS1在HCC患者血清外泌體中高表達，與HCC患者腫瘤分期、Child-pugh分級、AFP水平、淋巴轉移及預后有關，檢測血清外泌體lncRNA ZFAS表達水平對診斷HCC有一定參考價值，可作為HCC患者診斷及預后判斷的參考指標。A1BG-AS1為lncRNA的一種，有研究顯示，A1BG-AS1通過海綿miRNA-485-5p調控脂閥結構蛋白1的表達，調控乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲[10]。關于A1BG-AS1在其他腫瘤外泌體中的表達的報道較少。本研究結果顯示，PHC組患者血漿外泌體A1BG-AS1表達水平明顯低于肝硬化組，肝硬化組血漿外泌體A1BG-AS1表達水平明顯低于對照組，提示A1BG-AS1可能與PHC的發生有關。目前，A1BG-AS1在乳腺癌組織與HCC組織中呈異常表達，而本研究發現其在PHC患者血漿外泌體也存在異常表達，但本研究臨床樣本量較小，可能存在一定局限性，其在PHC中是否具有特異性有待進一步驗證。進一步分析血漿外泌體A1BG-AS1表達水平與PHC患者臨床病理特征關系顯示，PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1表達水平與腫瘤分期、肝功能分級和淋巴結轉移有關，與BAI等[4]研究結果一致，提示血漿外泌體A1BG-AS1低表達促進PHC進展與淋巴結轉移，推測A1BG-AS1在肝癌的發生、發展中發揮抑癌作用。本研究結果顯示，本研究血漿外泌體A1BG-AS1診斷PHC的AUC為0.842(95%CI：0.774～0.896)，靈敏度為89.33%，特異度為82.89%，提示檢測血漿外泌體A1BG-AS1對PHC具有一定診斷價值，A1BG-AS1、AFP聯合檢測診斷PHC的AUC為0.898(95%CI：0.839～0.941)，靈敏度為90.67%，特異度為75.00%，表明A1BG-AS1、AFP聯合檢測診斷PHC的診斷效能較高，有一定臨床應用價值。

本研究結果顯示，A1BG-AS1高表達PHC患者的3年生存率明顯高于A1BG-AS1低表達PHC患者，提示血漿外泌體A1BG-AS1低表達患者生存率較低，檢測血漿外泌體A1BG-AS1表達水平可預測PHC患者預后。進一步Cox回歸模型單因素和多因素分析結果顯示，腫瘤分期為T3～T4、有淋巴結轉移、A1BG-AS1低表達是影響PHC患者預后的獨立危險因素，提示血漿外泌體A1BG-AS1表達水平可影響患者預后，其可能作為判斷PHC患者預后情況的分子標志物。

綜上所述，PHC患者血漿外泌體A1BG-AS1低表達，其與患者臨床病理特征和預后有關，且血漿外泌體A1BG-AS1、AFP聯合檢測對PHC有較高診斷價值，可作為PHC診斷與判斷預后的標志物，但具體機制尚不清楚，仍需做進一步研究。