SFRP1和β-catenin在食管癌中的作用及相關機制*

馬軍偉,王 佳,宋 煒

延安大學附屬醫院腫瘤科，陜西延安 716000

食管癌是常見的上消化道腫瘤之一。目前，上消化道腫瘤是我國城市人口惡性腫瘤的重要死亡原因，同時也是世界范圍內相對常見、多發的惡性腫瘤之一，其病因與吸煙、職業、環境、電離輻射等有關[1-2]。近年來，雖然人類對食管癌的研究加深，但截至目前其發病機制尚未完全弄清。分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)和β-連環蛋白(β-catenin)是機體中的相對常見的2種生物學因子，在各種疾病的發生、發展和轉歸過程中均發揮了重要作用[3]。SFRP1作為一種新發現的候選抑癌基因，在人類的多種腫瘤包括上消化道腫瘤中均存在表達下調或缺失的現象[4]，而其失活的原因則可能與上消化道腫瘤的子區高甲基化被啟動有關。β-catenin是CTNNB1基因編碼的蛋白，可與鈣黏蛋白、α-catenin共同組成黏附連接復合體。既往研究顯示，β-catenin可作為信號分子介導細胞黏附和信號傳導[5]。一項Meta分析顯示，β-catenin在肝癌、腸癌、胃癌等疾病中起重要作用，與食管癌的不良預后、疾病進展及腫瘤侵襲性均密切相關[6]。本研究選取本院腫瘤科收治的121例食管癌患者作為研究對象，探討SFRP1、β-catenin在該病中的作用及其相關機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院腫瘤科2014年1月至2018年1月收治的121例食管癌患者作為研究對象進行前瞻性研究。納入標準：(1)符合中國抗癌協會食管癌專業委員會《食管癌規范化診療指南(2013版)》[7]中食管癌診斷標準；(2)活檢標本滿足診斷要求；(3)知情同意并簽署知情同意書；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)食管癌合并其他惡性病變；(2)病理學檢查時有放化療、生物免疫治療史；(3)治療期間死亡、轉院、失訪。121例食管癌患者中男78例，女43例；鱗癌51例，腺癌70例；腫瘤分化程度：高分化31例，中分化62例，低分化28例；癌轉移53例，未轉移68例。根據國際抗癌聯盟(UICC)和美國癌癥聯合會(AJCC)聯合制定的標準[8]，將121例食管癌患者分成Ⅰ期28例，Ⅱ期41例，Ⅲ期37例及Ⅳ期15例。本研究經本院醫學倫理委員會批準后執行。

1.2儀器與試劑 儀器：細胞質分析儀[亞德諾半導體技術(上海)有限公司]；全自動免疫組化檢測儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]等。試劑：鼠抗人SFRP1(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，規格：96T/49T)；鼠抗人β-catenin單克隆抗體(北京中山生物技術有限公司，型號：CAT-5H10)等。

1.3方法

1.3.1標本采集 操作者均為本院經驗豐富的檢驗科醫生，對本課題不知情，也不了解A、B組受試者的基線資料，采用單盲法判斷。采集所有受試者癌組織及癌旁組織標本，均于標本離體后0.5 h內取材，并分成2份：一份放置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于DNA提??；一份石蠟包埋，采用常規蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，用于免疫組織化學法(IHC) β-catenin檢測。

1.3.2檢測步驟 分別采用甲基化特異性PCR(MSP)和免疫組織化學法(IHC)檢測癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin水平。SFRP1檢測：提取癌組織及癌旁組織標本，提取DNA，采用細胞質分析儀檢測。β-catenin檢測：(1)癌組織及癌旁組織標本均采用中性福爾馬林脫水固定；(2)常規石蠟包埋和水化，接著用枸櫞酸鈉緩沖液(陜西興邦藥業有限公司，國藥準字H61022282)煮沸后孵育10 min，加一抗4 ℃孵育過夜；(3)加生物素標記的二抗處理后再次孵育10 min，用蘇木素復染，乙醇脫水，切片，然后用二甲苯透明中性樹膠(南京森貝伽生物科技有限公司，編號：SBJ0126)封片；(4)采用全自動免疫組化檢測儀進行檢測。

1.3.3SFRP1、β-catenin結果判定 SFRP1結果判定每張切片隨機選取10個高倍鏡(×40)視野，計算陽性細胞百分數。陰性：腫瘤陽性細胞數<10%；陽性：陽性表達定位于細胞質，細胞質有棕黃色顆粒，腫瘤陽性細胞數≥10%。

1.3.4β-catenin結果判定 陽性細胞百分數與SFRP1的判定結果相同。陰性：染色結果無著色或單純細胞質著色；陽性：呈棕黃色顆粒狀，主要位于細胞膜。

2 結 果

2.1癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin表達水平比較 食管癌癌組織SFRP1表達水平較癌旁組織明顯降低，β-catenin表達水平較癌旁組織明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin表達水平比較

2.2不同臨床病理特征食管癌患者SFRP1、β-catenin表達陽性率比較 是否淋巴結轉移食管癌患者SFRP1表達陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，β-catenin表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05)；不同病理類型、分化程度、TNM分期食管癌患者SFRP1、β-catenin表達陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 SFRP1、β-catenin表達與食管癌的臨床病理特征的關系(n)

3 討 論

既往研究證實，SFRP1在胚胎發育階段主要參與腦、血管等重要系統的細胞分化[9]，但當其成體后，存在于機體的諸多組織中。作為一種重要的抑制因子，SFRP1的作用多集中在Wnt信號(配體蛋白質Wnt和膜蛋白受體結合激發)上游，有研究證實，雖然其在正常狀態下對抵抗食管癌發生和發展、促進細胞凋亡等[10]生物過程均極有幫助，但若超過其臨界值時，則會損傷機體組織。

本研究結果發現，食管癌患者癌組織中SFRP1的表達水平低于癌旁組織(P<0.05)，而不同病理類型、分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移食管癌患者SFRP1蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)。結合文獻[10-12]及本研究結果，SFRP1在食管癌中的作用機制可能與以下幾點有關：(1)SFRP1參與Wnt信號轉導而對食管癌發生有影響。通常情況下，Wnt信號轉導在成體組織細胞中的作用主要是協助細胞增殖，但若機體受損時，這條信號通路中的關鍵蛋白突變，導致Wnt信號活化出現異常，繼而參與腫瘤發生。(2)SFRP1基因的第1個外顯子周圍有高密度的CpG島，其是發生甲基化的重要區域。有研究顯示，當機體中的SFRP1基因甲基化后Wnt信號通路則會被激活，繼而導致本途徑中的β-catenin在細胞質內累積、轉移或與該途徑中的某些轉錄因子結合[12]。而在這種情況下，靶基因的轉錄和表達也會隨著被刺激，繼而參與食管癌的發生、發展。(3)SFRP1可與Fra相互競爭而使Wnt信號通路被抑制。有研究發現，SFRP1利用部分類似氨基端序列結構與Wnt蛋白結合，進而抑制Wnt信號通路[13]。本研究中食管癌癌組織SFRP1陽性表達率明顯低于癌旁組織，提示SFRP1表達降低會抑制Wnt信號轉導，促進腫瘤細胞增殖。

作為一種細胞質蛋白，β-catenin主要分布于胞膜，可與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)相結合而形成的一種E-cadherin-β-catenin復合物。這種復合物在許多細胞反應中發揮重要作用，有研究證實β-catenin變異均會引起許多人類腫瘤，如結腸癌、肺癌[14-15]。正常情況下，腫瘤抑制(APC)基因對機體細胞中的β-catenin有較好的調節，促使β-catenin基因出現特殊片段磷酸化。然而，當β-catenin或APC基因突變時，細胞內的β-catenin水平隨之遞增，而其部分則會從胞膜上轉移至胞核內聚集。本研究結果顯示，β-catenin在食管癌癌組織中的表達較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。這表明β-catenin在食管癌病變組織呈高表達[16]，而癌旁組織陽性率較低，嚴重影響食管癌患者的預后生存率。通常情況下，β-catenin主要分為兩類，一類是游離型β-catenin，二類是結合型β-catenin。有研究證實，前者主要表達于食管癌細胞的細胞核中，是重要的靶基因，Wnt信號通路則是它與轉錄因子Tcf/Lef結合后形成的；后者的主要功能是調節細胞黏附功能，但無法進入細胞核，而這種調節功能還必須與其他細胞因子結合才可實現[17]。食管癌的發生則主要與游離型β-catenin相關，而導致這種現象的原因在于β-catenin降低了轉錄因子的轉錄活性，而使Wnt信號通路被激活，使信號轉導途徑異常而過度調節食管癌細胞的增殖[18]。因此，推測SFRP1與β-catenin之間還存在某種聯系，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，SFRP1低表達、β-catenin高表達可能是食管癌高發的主要誘因之一，二者主要通過相同的媒介物質Wnt信號通路導致食管癌的發生。SFRP1、β-catenin均在食管癌的發生、發展、轉歸及預后中發揮重要作用，可將其作為食管癌發生的早期腫瘤標志物。