濾紙法在三種溫度條件下保存標準菌株應用初探

文德學，莫梢梢，吳 健，李 瑩，王 麗，張 杰

黔西南州人民醫院醫學檢驗科，貴州興義 562400

實驗室質控工作需要保存各種標準(質控)菌株，而保證質控菌株的穩定是做好質控工作的前提條件。菌種保存的方法很多，根據不同的菌株或不同的實驗要求，可選用不同的保存方法，常見的方法有傳代培養保存法、液體石蠟覆蓋保存法、冷凍保存法、冷凍干燥保存法等[1]。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等非苛養菌質控菌株生長條件要求不高，通常用斜面瓊脂培養基和半固體瓊脂培養基覆蓋液狀石蠟等方法均可很好保存[2-3]，但需要頻繁移種以保證存活率，而反復傳代又易導致細菌變異并造成菌種污染。在保存過程中，需使微生物的代謝處于相對靜止狀態，以在一定的時間內使其不發生變異又保持很好的活性。低溫、干燥和隔絕空氣是使細菌代謝能力降低的重要因素。本課題組前期曾應用濾紙法保存標準菌株，基本滿足上述3個條件，保存效果也很好[4]。但是，溫度條件對一些基層醫院還是有一定的制約，尤其是-80 ℃醫用冰箱在基層醫院目前尚未完全普及，且菌種從-80 ℃復溫至室溫，對人員操作技術要求更高，溫差較大對菌株也會產生一定的影響。本實驗室在0 ℃條件下可保存非苛養類標準菌株至少3年，在-20 ℃、-80 ℃條件下可較長期(至少7年)保存非苛養類標準菌株。這可為基層醫院微生物室在質控工作中對標準菌株的有效保存提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標準菌株 大腸埃希氏菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)4種標準菌株購于國家衛生健康委員會臨檢中心。

1.1.2儀器與試劑 血平皿(安圖公司)；營養肉湯培養基(杭州天合微生物試劑有限公司)；0 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱(海爾公司)；二氧化碳培養箱(HF212)，全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(PhoenixM50)；配套的革蘭陽性PMIC/ID-55(448911)、革蘭陰性NMIC/ID-4(448505)鑒定藥敏試驗復合板。

1.2方法

1.2.1實驗前準備 (1)自封袋：根據需要購買適宜大小的自封袋。(2)無菌EP管：將市售直徑2 cm的EP管置于密閉的消毒盒內，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。(3)無菌濾紙條制備：將市售濾紙用剪刀剪成約0.5 cm × 1.0 cm 濾紙條，置于帶塞的小試管內，經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。(4)營養肉湯培養基配制：按照說明書配制成成品肉湯后，分裝于有塞小試管，每管1 mL，經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2.2標準菌株的保存 將標準菌株在血平皿上劃線分離培養18～24 h，獲取純菌落，然后用無菌眼科鑷夾取1張無菌濾紙條，根據菌落大小，粘取1到數個菌落(以粘菌面積不超過濾紙1/3，濾紙條尚未完全被水分浸濕為宜)，放入無菌EP管中，蓋緊EP管蓋。根據需要，一次可制備數10管，將1～2條無菌濾紙條裝一個EP管，貼上標簽，標簽上注明菌種名稱和保存日期，再置于自封袋內，排盡袋內空氣封嚴袋口，分別放入0 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱保存。

1.2.3標準菌株的生物學性狀觀察和檢測 將上述方法保存的4種標準菌株大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)在保存了1、2、3、7年后，取出上述各種菌種的一個EP管，直接置于室溫環境平衡5～10 min，無菌操作取出相應菌種濾紙條，放入無菌營養肉湯管中復融5～10 min，輕輕振搖混勻后取一環營養肉湯培養基轉種在血平皿上，置于35 ℃二氧化碳培養箱培養18～24 h，觀察菌株的存活情況、菌落形態特征等有無變化。用PhoenixM50全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行鑒定和藥敏試驗，比較標準菌株的基本生物學性狀和藥敏試驗結果變化情況。

2 結 果

2.1保存于0 ℃的4種標準菌株 保存于2014年的大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)，在保存1年(2015年)、2年(2016年)、3年(2017年)時，用營養肉湯復融后分別移種到血平皿培養基上，置于35 ℃二氧化碳培養箱培養18～24 h，觀察4種標準菌株均生長良好，存活率為100%，菌落形態特征沒有明顯改變，用PhoenixM50全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行鑒定和藥敏試驗，4種菌株相應的基本生物學性狀無改變，儀器鑒定菌種符合率為100%，藥敏試驗結果無明顯變化。見表1、2。

表1 0 ℃保存的革蘭陰性標準菌株藥敏試驗結果[最低抑菌濃度(MIC)法，μg/mL]

續表1 0 ℃保存的革蘭陰性標準菌株藥敏試驗結果[最低抑菌濃度(MIC)法，μg/mL]

2.2保存于-20 ℃、-80 ℃冰箱的4種標準菌株 保存于2014年的4種標準菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)在保存1年(2015年)、2年(2016年)、3年(2017年)、7年(2021年)時用營養肉湯復蘇分別移種到血平皿培養基上，置于35 ℃二氧化碳培養箱培養18～24 h，觀察4種標準菌株均生長良好，存活率為100%，除金黃色葡萄球菌(ATCC25923)在-20 ℃、-80 ℃條件下保存到第7年(2021年)時，用接種環取菌落時出現輕微拉絲現象外，其余菌落形態特征沒有明顯改變，用PhoenixM50全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行鑒定和藥敏試驗，4種菌株相應的基本生物學性狀無改變，儀器鑒定菌種符合率為100%，藥敏試驗結果無明顯變化，結果見表3、4、5、6。

表2 0 ℃保存的革蘭陽性標準菌株藥敏試驗結果(MIC法，μg/mL)

表3 大腸埃希菌(ATCC25922)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗結果(MIC法，μg/mL)

表4 銅綠假單胞菌(ATCC27853)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗結果(MIC法，μg/mL)

表5 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗結果(MIC法，μg/mL)

表6 糞腸球菌(ATCC29212)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗結果(MIC法，μg/mL)

續表6 糞腸球菌(ATCC29212)-20 ℃、-80 ℃保存4個時間段藥敏試驗結果(MIC法，μg/mL)

3 討 論

菌種保存溫度條件始終是重要的影響因素，4 ℃條件最容易獲取，試驗證明穩定性不好[5]，只能用于臨時性保存，不宜用于質控菌株的長期保存。在-80 ℃條件下菌種保存的穩定性是得到肯定的，多數研究證明可保存5～10年[6-7]。但是-80 ℃醫用冰箱在基層醫院目前尚未完全普及，且菌種從-80 ℃復溫至室溫，對人員操作技術要求要高一些，溫差較大對菌株也會產生一定的影響。在-20 ℃條件下，有報道濾紙片冷凍保存、滅菌牛奶保存、甘油保存可保存至少2年[8]，其他用多種方法保存多種菌種，一般保存1～5年[9-10]，根據不同菌種的特性，選擇適宜的保存方法和相應的溫度條件，才能獲得理想的保存效果[11]。本研究用濾紙法保存的4種標準菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、糞腸球菌(ATCC29212)，在0 ℃條件下保存3年或在-20 ℃、-80 ℃條件下保存7年，4種標準菌株均生長良好，存活率為100%，菌落形態特征沒有明顯改變，用PhoenixM50全自動細菌鑒定儀及配套鑒定藥敏試驗復合板進行鑒定和藥敏試驗，菌株相應的基本生物學性狀無改變，儀器鑒定菌種符合率為100%，藥敏試驗無明顯變化，少部分檢測值有變化，但不排除儀器及試劑的原因。這提示該方法保存的標準菌株在 0 ℃條件下保存3年或在-20 ℃、-80 ℃條件下保存7年，菌株相應的基本生物學性狀和藥敏試驗結果是穩定的。

本研究結果表明，濾紙保存法在0 ℃條件下保存非苛養菌標準菌株，3年內能滿足實驗室室內質控的要求，在-20 ℃、-80 ℃條件下保存非苛養菌標準菌株，7年內能滿足實驗室內質控的要求。基層醫院微生物實驗室，在扎實做好菌種保存管理工作的前提下[12]，用濾紙法選擇在0 ℃、-20 ℃條件下保存非苛養菌標準菌株，是一個能滿足實驗室室內質控要求，操作簡便，實用有效、安全的菌種保存方法。