雷珠單抗球內注射治療視網膜靜脈阻塞并發黃斑水腫血清細胞因子變化及意義的研究

單俊杰，繆麗萍，葉 軍，曹國平

（泰州市人民醫院 眼科，江蘇 泰州 225300）

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是繼糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）之后第二大最常見的視網膜血管疾病，黃斑水腫（macularedema，ME）是RVO常見的并發癥，是RVO患者視力受損的主要原因之一。促血管生成細胞因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）被認為是導致視網膜疾病中血管滲漏的主要因素，導致ME的形成。與VEGF一樣，各種炎癥因素也被認為參與了RVO-ME的發病機制[1,2]。許多研究表明RVO-ME患者玻璃體中VEGF、白細胞介素（interleukin，IL）-8、IL-6、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblastgrowth factor，b-FGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平顯著升高[3,4]。

抗VEGF治療已被廣泛應用于臨床，并被證明是治療視網膜血管疾病的有效途徑。雷珠單抗（Lucentis）是單一的含有對人源性VEGF-A發揮靶向作用的單克隆抗體Fab片段，并阻礙血管內皮細胞增殖，避免新生血管生成，消除水腫和炎癥反應的作用，短期內可顯著減輕黃斑水腫的程度，提高患眼視力。雷珠單抗的眼部ME治療還存在復發、耐藥性、藥品的價格高、藥品使用次數多、治療時間間隔不確定等問題。因此基于雷珠單抗治療的現狀，制定適合患者的個體化治療是臨床醫學發展的方向。研究一種有效預測RVOME發病風險、評估抗VEGF治療后視力的方法成為抗VEGF治療RVO并發黃斑水腫所需要面對的一個重要問題。目前未見有對RVO-ME患者抗VEGF治療前后血清中炎癥相關細胞因子的系統研究，因此，我們測量了RVO-ME患者血清中IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17A，IL-1b，IL-12p70，TNF-a，干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ），IFN-a，VEGF，血管生成素II（angiopoietin II，ANG-II）等14種炎癥相關細胞因子的水平，以確定RVO患者血清中炎癥因子水平是否與抗VEGF治療的預后相關。

1 對象和方法

1.1 對象本研究經過醫院倫理委員會批準（KY202004301），且患者及家屬均同意治療并簽署治療同意書。隨機選取2021年1月至6月在江蘇省泰州市人民醫院眼科就診確診的RVO繼發黃斑水腫患者20例20眼（男11例，女9例，平均年齡61.50±15.49，21～79歲），對照組為健康體檢者20例。入組標準為:（1）通過詳細的癥狀、體征、最佳矯正視力（best corrected visual acuity，BCVA）、眼壓、裂隙燈、間接眼底鏡、眼底彩照、光學相干斷層掃描技術（optical coherence tomography，OCT）、熒光素眼底血管造影術（fluorescein fundus angiography，FFA）檢查確診RVO，并伴有明顯的黃斑水腫（CMT≥300μm）;（2）首次診斷為RVO-ME，并接受玻璃體內注射0.05ml雷珠單抗，并按要求參加所有隨訪。排除標準如下:（1）視網膜新生血管和/或新生血管性繼發性青光眼;（2）DR、青光眼或其他嚴重損害視力的眼部疾病;（3）眼科手術史。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 手術在標準層流手術室進行，患者仰臥位，內眼手術常規消毒、鋪巾后，開瞼器打開患眼瞼，奧布卡因表面麻醉2次，稀釋后的聚維酮碘浸泡結膜囊1分鐘，避開角膜，生理鹽水沖洗結膜囊2次，專用針頭抽取10mg/mL雷珠單抗0.05mL（0.5mg），更換無菌針頭，避開球結膜的血管于角鞏膜緣后3.5或4mm處即睫狀體平部穿刺注射，去除針頭后，立即用無菌棉簽壓迫1分鐘，檢查注射眼眼壓、有無光感、瞳孔對光反應情況，觀察無活動性出血及玻璃體嵌頓等后遮蓋術眼至次日。所有患者手術均順利，無術中眼壓升高及前房穿刺操作，無其他術中及術后并發癥的出現。術后予以左氧氟沙星滴眼液4次/日，點術眼7天。定期復診。

1.2.2 檢測方法 所有患者于治療前，治療后1周、2周、1月分別用EDTA抗凝管采集靜脈血樣本（3～5ml），樣本采集后的30分鐘內于4℃，1000xg離心15min，分離血漿，然后在-80°C下冷凍儲存。

采用ELISA方法檢測血清中VEGF（Human VEGF-A ELISA試劑盒，ELH-VEGF-1,廣州瑞博奧生物科技股份有限公司）、ANG-II（人血管生成素II ELISA試劑盒，DG11462H,北京冬歌博業生物科技有限公司）水平，采用流式細胞儀（細胞因子聯合檢測試劑盒，20210301，Cytek DxP Athena，江西賽基生物科技有限公司）檢測血清中IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17A，IL-1b，IL-12p70，TNF-a，IFN-y，IFN-a的表達水平。

1.2.3 統計學分析 采用SPSS 25.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）軟件進行統計分析，以P＜0.05作為差異有統計學意義。本研究中的定量資料不滿足正態性，以中位數（四分位數間距）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，治療前后比較采用相關樣本的Friedman檢驗。RVO的影響因素分析以是否為RVO為因變量，以具有統計學差異的相關因子（采用向前：有條件法進行自變量的篩選）為自變量，進行Logistic多因素回歸分析。

2 結果

2.1 RVO組與健康對照組血清細胞因子水平的比較RVO組的血清IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、IFN-a、VEGF基線水平均顯著高于健康對照組，且差異具有統計學意義。RVO患者血清中的IFNγ和ANG-II基線水平也高于健康對照組，但差異未見統計學意義。具體見表1。

表1 RVO組與對照組細胞因子的比較

2.2 RVO的影響因素分析RVO的影響因素分析以是否為RVO為因變量，以具有統計學差異的相關因子（采用向前：有條件法進行自變量的篩選）為自變量，進行Logistic多因素回歸分析（表2）。結果表明，IL-8（OR=1.30，95%CI：1.01～1.68）和VEGF（OR=1.16，95%CI：1.00～1.35）是RVO發生的獨立危險因素。

表2 RVO影響因素的logistic回歸分析

表3 治療前后療效和相關因子的變化

2.3 RVO組治療前后相關因子的變化研究組檢測了RVO組在抗VEGF治療前以及治療后1周、2周、1月的最佳矯正視力（BCVA）、中心視網膜厚度（CMT）以及相關炎癥因子水平。相較治療前0.10（0.05～0.25），RVO患者的視力在抗VEGF治療后有了明顯的提高，治療后1周：0.20（0.10～0.50）、治療后2周：0.30（0.16～0.50）、治療后1月：0.30（0.20～0.49）。RVO患者CMT治療后也有了明顯下降，由治療前的576.00μm（449.50～653.00）依次下降為314.00μm（284.00～397.50）、 282.00μm （237.00～342.00）、271.00μm（241.50～297.00）（圖1）。接 受 抗VEFG治療后，RVO組患者血清VEGF的表達量也呈現逐步下降的趨勢（圖2）。然而，與治療前相比，IL-6、IL-8在抗VEGF治療后呈現升高的趨勢，且組間差異均具有統計學意義。

圖1 抗VEGF治療前后BCVA、CMT變化

圖2 抗VEGF治療前后VEGF變化

3 討論

目前許多研究證實，在RVO患者的玻璃體或房水中，促炎因子，如IL-6、IL-8、TNF-α、VEGF等，顯著上調，并與黃斑水腫的嚴重程度相關[4-6]。然而，較少研究關注RVO患者血清中各種炎癥相關因子與抗VEGF治療的關系。因此，本研究比較了RVO組與健康組血清相關促炎細胞因子水平，以及抗VEGF治療前后，RVO患者的BCVA、CMT以及促炎細胞因子表達量的變化。研究結果顯示，與對照組相比，RVO組患者血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、VEGF等炎癥細胞因子的表達均明顯升高，且差異均具有統計學意義。其中，IL-8、VEGF還顯示是RVO發生的獨立危險因素，在疾病的發展過程中起到了顯著的作用。本研究還比較了RVO患者在接受抗VEGF治療前，以及治療后1周、2周、1月各項指標的變化。研究結果顯示，相較治療前，RVO患者的視力（BCVA）在治療后顯著提高，CMT以及血清VEGF表達量在抗VEGF治療后呈現逐步下降的趨勢。然而，與治療前相比，RVO患者血清中的IL-6、IL-8在抗VEGF治療后呈現升高的趨勢。

IL-6,IL-8是一種重要的促炎細胞因子，可以直接或間接誘導各種其他炎性細胞因子的生成。被認為通過誘導VEGF的表達來增加血管通透性和新生血管生成[7]。

視網膜缺血缺氧與RVO-ME的發病機制有關。缺氧會導致血管內皮生長因子（VEGF）表達增加，大量研究認為VEGF在RVO-ME的發生及進展過程中起到關鍵調控作用，RVO患者玻璃體、房水中VEGF的含量較正常明顯升高，且與ME的嚴重程度正相關[8]。

與預期相同，本研究結果顯示，與對照組相比，RVO組患者血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、等炎癥細胞因子的表達以及VEGF均明顯升高，提示炎癥在RVO中發揮重要作用，且血清與眼內液中細胞因子表達水平存在一致性。

目前，抗VEGF治療仍是RVO-ME的一線治療方案。針對RVO組的高VEGF水平，本研究采用了對VEGF-A亞型有較強的親和力的雷珠單抗來進行治療。雷珠單抗有強靶向性，可針對性地抑制VEGF-A與其受體VEGFA-1和VEGFA-2結合，阻礙血管內皮細胞增殖，避免新生血管生成，減輕水腫和炎癥反應，短期內可顯著減輕黃斑水腫的程度，提高患眼視力。正如本研究結果顯示，相較治療前，RVO-ME患者的視力（BCVA）在治療后顯著提高，CMT以及血清VEGF表達量在抗VEGF治療后呈現逐步下降的趨勢。

然而，抗VEGF藥物對眼內炎癥介質的作用似乎有限。在之前的一項研究中，球內注射貝伐單抗治療可降低眼內VEGF濃度，而對其他炎癥細胞因子的濃度沒有影響[9]。Funk[10]等人研究了RVO患者接受抗VEGF治療時眼內細胞因子濃度的變化，發現治療后VEGF和HIF1-a濃度降低，而其他炎癥細胞因子濃度未見明顯改變。

本研究檢測了抗VEGF治療前后，RVO-ME患者血清中各炎癥細胞因子的表達水平，結果顯示大部分細胞因子表達水平未見明顯改變。然而，相比較抗VEGF治療前，IL-6、IL-8在治療后1周、2周、1月均顯示表達增加，且具有統計學意義。Agawa等[11]檢測了37例老年性黃斑變性（AMD）患者房水中的23種炎癥細胞因子，發現實驗組玻璃體腔注射貝伐單抗2天后，VEGF水平降低，而IL-6和IL-8明顯升高，推測玻璃體內注射抗VEGF藥物可誘導炎癥反應，增加炎癥細胞因子表達水平，其相關作用機理還有待進一步研究。

本研究存在幾個局限性。首先，樣本量偏小，治療后1月的失訪率較高。此外，沒有采集眼內液，比如房水或玻璃體樣本，因此，無法研究眼內細胞因子，并將其與血清細胞因子的表達變化進行比較。

綜上所述，本研究證明了RVO-ME患者的血清中炎癥細胞因子明顯升高。其中，IL-8、VEGF還顯示是RVO發生的獨立危險因素，在疾病的發展過程中起到了顯著的作用。玻璃體內注射雷珠單抗可以降低VEGF的表達，減輕黃斑水腫程度（CMT）以及提高患者視力（BCVA）。研究顯示抗VEGF藥物對RVO-ME患者血清炎癥細胞因子的作用似乎有限，但IL-6、IL-8在抗VEGF治療后反而增加，提示璃體內注射抗VEGF藥物可能通過誘導炎癥反應，增加炎癥細胞因子的表達水平。因此，針對RVO炎癥和血管生成相關因素的進一步研究可能會導致新的治療靶點的開發，以改善目前RVO的治療。