煙草株高和葉數性狀QTL定位及候選基因預測

姜自鵬　趙會納　苑廣迪　蔣彩虹　劉旦　余世洲 雷波　程立銳　楊愛國　付憲奎

摘??要：為明確煙草株高和葉數性狀的遺傳規律，發掘控制相關性狀的主效位點，以臺煙8號（TT8）為母本（P1），NC82為父本（P2），配置雜交組合，以TT8為輪回親本回交，構建了包含200個單株的BC1F1群體。在此基礎上，分別在四川、山東兩個環境點種植群體材料，獲得株高和葉數表型，進而利用高密度遺傳圖譜對株高和葉數性狀進行QTL定位分析。結果表明，在兩個環境條件下共定位到4個與株高和葉數相關的主效QTL，每個QTL均可以解釋相應性狀10%～20%的表型變異。兩個環境點定位到2個葉數性狀QTL，均位于23號連鎖群上，非等位;定位到3個株高性狀主效QTL，四川點1個位于23號連鎖群上，山東點2個分別位于21號和23號連鎖群上，其中山東點23號連鎖群上的主效位點與控制葉數的主效QTL遺傳位置一致。相關結果為進一步克隆控制株高和葉數性狀的主效基因及煙草重要農藝性狀分子改良奠定了基礎。

關鍵詞：株高;葉數;遺傳圖譜;QTL定位;候選基因預測

QTL Mapping and Prediction?of Candidate Genes for Plant Height and Leaf Number in Tobacco

JIANG Zipeng ?ZHAO Huina YUAN Guangdi JIANG Caihong ?LIU Dan YU Shizhou

LEI Bo CHENG Lirui YANG Aiguo ?FU Xiankui

Abstract：In order to clarify the genetic rules of plant height and leaf number traits of tobacco and explore the main effective loci controlling related traits，?a BC1F1 population containing 200 individual plants was constructed by using Taiyan 8 （TT8） as?the?female parent （P1） and NC82 as?the?male parent （P2）， and backcrossing TT8 as recurrent parent.?The?plant height and leaf number phenotypes were obtained by planting population materials in Sichuan and Shandong respectively.?And then QTL mapping for plant height and leaf number traits was performed?based on the high-density genetic map.?The results showed that four major QTLs related to plant height and leaf number were located under two environmental conditions， which could explain 10%-20% of the phenotypic variation of the corresponding trait.?At?two environmental sites， two QTLs for leaf number traits were mapped， which were non-allelic and located on?the 23 linkage group; three major QTLs for plant height traits were identified， including one in Sichuan was located on the 23 linkage group and two in Shandong were located on the 21 and 23 linkage groups?respectively.?The major loci of plant height located on the 23 linkage group in Shandong is consistent with that of the major QTL of leaf number.?The related studies laid a foundation for further cloning the major genes controlling plant height and leaf number traits and molecular improvement of important agronomic traits in tobacco.

Keywords： plant height; leaf number; genetic map; QTL mapping; prediction of candidate genes

株高和葉數是煙草重要的農藝性狀，與煙草的產量和品質有緊密的聯系^[1-3]。因此，要提高煙葉的產量和品質，就必須對其相關性狀進行改良。煙草基本農藝性狀、抗性和品質等重要性狀大多都屬于復雜數量性狀^[4-5]，受多基因控制，易受環境影響。煙草是一個典型的大植物基因組^[6]，基因組大小有4.5 Gb，其中重復序列含量達到基因組序列的60%～80%，不同種質間遺傳差異較小，這極大限制了煙草數量性狀遺傳研究。

目前，關于煙草株高和葉數性狀QTL定位分析雖有報道，但大多是基于低質量的煙草遺傳圖譜進行的，這可能導致獲得的QTL數量較少、準確度和精細度低，影響煙草株高和葉數性狀的分子改良。蔡長春等^[7]利用僅含23個連鎖群的不完整的遺傳連鎖圖譜檢測到1個與葉數相關的QTL。李茜^[8]利用SSR和SRAP標記技術構建遺傳連鎖圖譜，檢測到2個與葉數相關的QTL均位于16和17號連鎖群上，3個與株高相關的QTL分別位于2、17和19

號連鎖群。童治軍等^[9]基于SSR標記的遺傳圖譜定位到了13個與株高相關的QTL、10個與葉片數相關的QTL，但大部分效應值較小，難以在生產中得到有效利用;之后又利用重組自交系群體構建了一張包含626個SSR標記的遺傳連鎖圖譜，發現了5個與葉片數相關QTL，分別分布于第3、4、7、17、和22號連鎖群上，6個與株高相關的QTL分別分布于3、7、13、14、17、和24號連鎖群上，均具有較高的效應值，為培育高產煙草新品種提供了理論依據^[10]。

基于限制性酶切位點DNA測序（Restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）是在第二代測序基礎上發展而來的一項基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術^[11]。RAD-seq測序技術具有標記數量高，準確性高、數據利用率高等優點，被廣泛應用于高密度遺傳圖譜的構建、高密度單核苷酸多態性（SNP）標記開發，植物重要性狀的QTL定位等研究^[12-13]，解決了利用傳統的分子標記很難覆蓋全基因組的問題。

本研究組前期以RAD-seq技術構建了高密度遺傳圖譜^[14]，在此基礎上，本文以TT8為母本，NC82為父本，配置雜交組合F1，F1回交于TT8，得到由200個子代組成的BC1F1群體，對與煙草產量和品質相關的株高和葉數兩個重要性狀進行QTL定位分析，并對候選基因進行預測，以期為今后進一步研究株高和葉數性狀分子育種及開展煙草重要農藝性狀分子改良提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1??供試材料與試驗設計

本試驗以TT8為母本（P1），以NC82為父本（P2）。其中NC82是美國烤煙類型品種，TT8為我國培育的烤煙品種，兩品種在株高和葉數農藝性狀中表現有顯著差異。兩者均由中國農業科學院煙草研究所提供。

2016年3—9月，在中國農業科學院煙草研究所青島試驗基地利用TT8與NC82雜交獲得F1種子;2017年3—9月，在青島試驗基地利用F1回交TT8獲得BC1F1群體種子。2018年分別在中國農業科學院煙草研究所諸城試驗基地和中國農業科學院煙草研究所西南試驗基地種植200個BC1F1群體。為了獲得穩定、可靠的數據，將每個BC1F1單株利用組織快繁50株，用于田間種植。田間種植設2個重復，每個材料每重復種植10株，株距50?cm，行距120?cm，按當地優質煙生產技術措施進行栽培管理。每個重復隨機調查5個單株，取平均值。

1.2 ?表型調查

煙草株高和葉數的測定按照YC/T142—2010《煙草農藝性狀調查方法》要求進行。

1.3 ?數據統計與分析

采用Excel 2019軟件，對200個BC1F1材料的株高和葉數性狀進行整理和統計性分析。

1.4??QTL定位分析

利用本研究組前期以母本TT8、父本NC82、F1以及200個BC1F1群體構建的煙草遺傳圖譜^[14]，結合株高和葉數的田間表型數據，利用QTL IciMapping 4.2軟件，利用ICIM-ADD作圖方法對煙草株高和葉數性狀進行QTL定位，設置閾值為2.5，若在SNP標記中檢測到LOD大于或等于2.5，則認為該處存在QTL。按照MCCOUCH^[15]等規則進行QTL的命名。使用Mapchart 2.2繪制遺傳圖譜。

1.5 ?株高和葉數性狀相關候選基因預測

根據QTL定位的結果，利用中國煙草基因組數據庫（http：//218.28.140.17/）注釋目標區段內的基因功能，查閱可能與葉數和株高性狀相關的基因，進行候選基因預測。

2 ?結??果

2.1??株高和葉數性狀表型分析

在兩個環境條件下，親本和BC1F1群體的株高和葉數性狀表型值如表1所示，在BC1F1群體中，不同株系間株高和葉數差異顯著，表現為連續性變異。在四川點，葉數的變異幅度為11～20.50片，平均16.04片，株高的變異幅度為142.06～193.57 cm，平均161.95 cm;在山東點，葉數的變異幅度為15.61～26.36片，平均為22.38片，株高的變異幅度為53.75～185 cm，平均126.52?cm;兩性狀的平均值均介于雙親之間，且存在雙向超親個體。株高和葉數性狀變異系數在3.90%～9.70%之間，說明BC1F1群體中兩性狀存在較大的分離。統計兩個地點株高

和葉數性狀的偏度和峰度發現，偏度的絕對值在0.35～0.98之間，峰度的絕對值在4.60～10.66之間，符合單峰正態分布的特征，表明株高和葉數屬于數量性狀。方差分析表明（表2），煙草株高和葉數性狀在不同基因型之間均存在顯著差異，在不同的環境和基因型與環境互作中也存在顯著差異。

2.2??株高和葉數性狀QTL定位分析

本研究針對株高和葉數兩個性狀進行全基因組QTL掃描，共檢測到4個QTL（表3，圖1），分別分布在第21和第23號連鎖群上。

在四川和山東試驗基地檢測到與葉數相關的QTL各1個，分別命名為qLN23-1和qLN23-2。四川點qLN23-1位于23號連鎖群maker69553-maker76610標記之間，可解釋19.34%的遺傳變異;山東點qLN23-2位于23號連鎖群標記maker45399-maker47428標記之間，可解釋總表型變異的14.81%。雖然兩個環境點在23號連鎖群上都可以定位到一個控制葉數的主效QTL，但兩個QTL所在遺傳位置差距較大，不是同一主效位點。

檢測到與株高相關的QTL有3個，分別命名為qPH23-1、qPH23-2和qPH21。在四川和山東試驗基地檢測到的qPH23-1和qPH23-2均分布在23號連鎖群上，qPH23-1位于標記maker9429和標記maker222554之間，可解釋19.76%的表型遺傳變異;qPH23-2位于標記maker45399和標記maker47428之間，可解釋總表型變異的19.99%，兩者位置相近;同時，位于山東點23號連鎖群上控制株高（qPH23-2）和葉數性狀（qLN23-2）的主效位點的位置一致。除此之外，在山東試驗基地還檢測到一個QTL（qPH21）位于21號連鎖群上，位于標記maker17152和標記maker1243之間，可解釋10.46%的表型遺傳變異。

2.3??預測候選基因

根據QTL定位和分析的結果，位于23號連鎖群上的主效位點存在一因多效，可能與葉數和株高性狀緊密相關。因此，在中國煙草基因組數據庫（http：//218.28.140.17/）網站中以該主效位點所對應的紅花大金元參考基因組的物理位置進行候選基因的篩選。如表4所示，目標區間內共有15個編碼基因，注釋功能為E3泛素蛋白連接酶、bHLH68轉錄因子、核孔復合體蛋白、膜結合酰基轉移酶C24H6.01c、肽/硝酸鹽轉運體、MYB86轉錄因子、類轉座子蛋白、疏水蛋白RCI2B、生長素誘導蛋白等等。其中Ntab0789630編碼與擬南芥bHLH68轉錄因子功能相似的蛋白，與側根的發育、胚軸的伸長和調控不同生理過程有關^[16-19];Ntab0035030與擬南芥MYB轉錄因家族MYB86相似，與黃酮類物質含量和花青素積累有關^[20-22];Ntab0702260與擬南芥生長素誘導蛋白SAUR71相似，在細胞生長、根分生組織發育和生長素運輸中起到調節作用^[23]。因此，初步將Ntab0789630和Ntab0702260確定為控制煙草株高和葉數關鍵候選基因。

3 ?討??論

3.1 ?株高和葉數性狀的QTL定位及候選基因分析

本研究利用200個BC1F1群體分別在四川、山東兩個環境點評價群體材料的株高和葉數性狀，獲得穩定、可靠表型，進而利用構建的高密度的遺傳圖譜對株高和葉數性狀進行全基因組QTL定位分析，共檢測到4個與株高和葉數相關的主效QTL。本研究獲得的葉數性狀的主效QTL位于23號連鎖群上，控制株高性狀的主效QTL位于21和23號連鎖群上，均是新發現的QTL位點，均可以解釋10%以上的表型變異，研究結果具有真實性和可信度。山東點位于23號連鎖群上控制株高和葉數性狀的主效位點的位置一致，說明這個位點具有一因多效的作用。但是，本研究的結果與李茜^[8]和童治軍等^[10]報道的結果不一致，說明在不同種質資源中存在著多個控制株高和葉數性狀的非等位主效位點。

針對我們定位到的控制株高和葉數的主效位點，初步開展了候選基因預測。在目標區間內，預測了2個控制煙草株高和葉數性狀的關鍵候選基因。植物株高和葉數性狀的發育與細胞的分裂和生長過程有關，同時受多種植物激素的調控。bHLH68轉錄因子通過參與脫落酸（ABA）的調控表達從而影響植物的器官發育和抗旱性^[17]。bHLH （Basic helix-loop-helix）轉錄因子家族是最大的基因家族之一，bHLH通過自身特定的功能域與靶基因相互識別并作用，進而通過代謝信號通路調控相關基因的表達在調控植物生長發育、逆境脅迫和次生代謝等過程中起關鍵作用^[24-27]。SAUR71是生長素應答基因家族SAUR的一種調控因子，在細胞增殖和擴張過程中起作用，可能參與調控植物株高和葉片數的發育過程。因此，根據定位結果及候選基因分析，初步確定Ntab0789630和Ntab0702260為候選基因，相關功能驗證正在開展中。

3.2 ?株高和葉數性狀在育種改良上的應用

利用BC1F1群體和高密度遺傳連鎖圖譜，我們定位到了4個與株高和葉數相關的QTL，為今后進一步挖掘相關的候選基因和煙草改良奠定了基礎。煙草的各個植物學性狀的綜合表現與它們之間復雜的相關性、遺傳控制和環境效應均有直接或間接的關系。童治軍等^[28]和朱惠琴等^[29]對煙草各農藝性狀的研究表明，株高、葉數、節距、葉長、葉寬等農藝性狀間具有顯著的相關性。WHITE等^[30]和殷英等^[31]的研究結果表明，煙草產量和葉片數、株高有較高的正相關。因此，本研究發掘的控制株高和葉數的主效QTL及緊密連鎖的分子標記，可為煙草重要農藝性狀改良提供可操作的遺傳單元，同時對培育優質、適產新品種也有一定意義。

4 ?結??論

本研究基于高密度的遺傳連鎖圖譜，結合200個BC1F1群體在兩環境下的表型，共挖掘到4個與株高和葉數性狀有關的QTL，根據QTL定位和分析的結果，對候選基因進行了預測，為今后進一步開展煙草株高和葉數性狀的主效基因克隆及分子育種奠定基礎。

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基金項目：中國煙草總公司科技重大專項項目（110202001027）;中國農業科學院科技創新工程（ASTRP-TRI01）

作者簡介：姜自鵬（1994-），女，在讀碩士研究生，主要研究領域：分子育種。E-mail：jiangzipeng59@163.com。*通信作者，E-mail：fuxiankui@caas.cn

收稿日期：2021-08-23 ????????????????修回日期：2022-02-15