益氣溫陽方對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜線粒體動(dòng)態(tài)變化及活性氧的影響

陳旭青，周龍?jiān)疲R華安，劉書芬，吳繼勇，嚴(yán)芮雯，嚴(yán)道南

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 210032

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）為耳鼻喉科臨床常見病之一。一項(xiàng)全國(guó)11個(gè)城市隨機(jī)抽樣調(diào)查表明，2011年AR自報(bào)患病率平均為17.6%，較2005年患病率11.1%顯著升高。研究顯示，線粒體動(dòng)態(tài)變化與AR等變應(yīng)性疾病關(guān)系密切。線粒體過度分裂及下游活性氧（ROS）水平升高可介導(dǎo)多種變應(yīng)性疾病。南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院嚴(yán)道南教授從事AR臨床診治及基礎(chǔ)研究數(shù)十年，將AR病機(jī)歸納為“肺脾虛寒，清竅失煦不利，涕液統(tǒng)率失職”，提出AR“補(bǔ)肺益氣，溫陽散寒”治法，并據(jù)國(guó)醫(yī)大師干祖望經(jīng)驗(yàn)方加減創(chuàng)制益氣溫陽方，該方具有助益氣陽、溫肺散寒之功，臨床療效較好。前期研究顯示，該方能有效緩解AR患者鼻癢、噴嚏、流清涕、鼻塞等癥狀，抑制小鼠Th2型免疫應(yīng)答，改善鼻黏膜局部炎癥及損傷，但其具體作用機(jī)制尚不明確。線粒體作為細(xì)胞的能量中心，成為細(xì)胞內(nèi)在“氣、陽”的象征。本研究從線粒體動(dòng)態(tài)平衡角度，探討益氣溫陽方干預(yù)AR的潛在機(jī)制，為中醫(yī)藥治療AR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠40只，6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)20180004040960，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0004。飼養(yǎng)于溫度22～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60%環(huán)境，光照時(shí)間12 h，自由攝食飲水，墊料每3 d更換1次。

1.2 藥物及制備

益氣溫陽方（黃芪15 g，黨參10 g，干姜9 g，桂枝10 g，麻黃6 g，五味子10 g，地龍10 g，烏梅10 g，甘草3 g），飲片購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，加水常規(guī)煎煮，濾液濃縮至含原藥材0.7 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｂ壤姿ㄆ荻t(yī)藥（上海）有限公司，10 mg/片，批號(hào)JS14813。取氯雷他定片研碎，加純水配制成濃度為83.35 μg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5、γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒（貨號(hào)分別為70-EK204HS-96、70-EK205HS-96、70-EK280HS-96），杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；ROS熒光探針試劑盒（貨號(hào)E004-1-1），南京建成生物工程研究所；卵清蛋白（OVA，貨號(hào)O1641），美國(guó)Sigam公司；氫氧化鋁（貨號(hào)C0151520323），南京化學(xué)試劑公司。體視顯微鏡（型號(hào)SZ51，日本Olympus公司），透射電子顯微鏡（型號(hào)Libra200，德國(guó)Carl Zeiss公司），多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)SpectraMax M5，美國(guó)Molecular Devices公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

40只C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、益氣溫陽方組和氯雷他定組，每組10只。參考文獻(xiàn)[11-12]制備AR小鼠模型，造模分為2個(gè)階段：基礎(chǔ)致敏階段，除空白組外，其余各組小鼠分別于第0、7、14日腹腔注射致敏液300 μL（含25 μg OVA、1 mg氫氧化鋁）致敏，空白組于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水；攻擊致敏在第21～27日連續(xù)進(jìn)行，除空白組外，其余各組小鼠以20 μL/只OVA溶液（500 μg OVA溶于生理鹽水）滴入雙側(cè)鼻腔，每側(cè)10 μL，每日1次，空白組滴入等量生理鹽水。造模第15～27日，益氣溫陽方組和氯雷他定組分別以14 g/kg、1.67 mg/kg相應(yīng)藥液灌胃，灌胃體積20 mL/kg（第21～27日于攻擊致敏前1 h給藥），空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，至第27日結(jié)束。

2.2 鼻過敏癥狀觀察

造模第21、23、27日，于小鼠鼻腔攻擊致敏后立即觀察15 min，以盲法記錄小鼠搔鼻、噴嚏情況。

2.3 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第28日，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，眼底靜脈叢取血，4 ℃、1 000×離心10 min，分離上層血清，ELISA檢測(cè)血清IL-4、IL-5、IFN-γ含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.4 鼻黏膜病理形態(tài)觀察及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

（＜0.01）；與模型組比較，益氣溫陽方組和氯雷他定組小鼠血清IL-4、IL-5含量明顯減少，IFN-γ含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。益氣溫陽方組和氯雷他定組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清IL-4、IL-5、IFN-γ含量比較（±s，pg/mL）

頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠頭部置于4%多聚甲醛中固定3 d，切取鼻尖至鼻根部10 mm組織，置于10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣5 d，經(jīng)20%、30%蔗糖溶液脫水，OCT膠包埋，切片（7 μm），HE染色觀察小鼠鼻黏膜組織病理變化并計(jì)算高倍視野下（400倍）嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。

2.5 活性氧檢測(cè)

頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剝離鼻黏膜并剪碎，加入預(yù)冷PBS研磨，制成組織勻漿，4 ℃、1 000×離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取95 μL上清液加至96孔板，加入2 mmol/L DCFH-DA溶液5 μL，37 ℃避光孵育30 min，以激發(fā)波長(zhǎng)480 nm測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度，計(jì)算ROS含量。

2.6 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

取固定后的小鼠頭部，小心剝離鼻中隔黏膜，經(jīng)2.5%戊二醛固定、2%鋨酸固定、PBS漂洗、梯度乙醇脫水、樹脂包埋，超薄切片機(jī)制備70 nm厚組織切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸染色后，將樣品置于透射電鏡下觀察小鼠鼻黏膜超微結(jié)構(gòu)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 益氣溫陽方對(duì)模型小鼠鼻過敏癥狀的影響

造模第21、23、27日，與空白組比較，模型組小鼠搔鼻、噴嚏次數(shù)明顯增加（＜0.01）；造模第23、27日，與模型組比較，益氣溫陽方組和氯雷他定組小鼠搔鼻、噴嚏次數(shù)明顯減少（＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠搔鼻、噴嚏次數(shù)比較（±s，每組10只）

4.2 益氣溫陽方對(duì)模型小鼠血清白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-5、干擾素-γ含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清IL-4、IL-5含量明顯增加，IFN-γ含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

4.3 益氣溫陽方對(duì)模型小鼠鼻黏膜病理形態(tài)的影響

HE染色顯示，空白組小鼠鼻黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜下未見明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)無明顯增生、水腫；模型組小鼠鼻黏膜上皮破壞明顯，纖毛紊亂，黏膜下可見大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，數(shù)量較空白組明顯增加（＜0.01），間質(zhì)出現(xiàn)增生及水腫；益氣溫陽方組和氯雷他定組小鼠鼻黏膜上皮損傷及纖毛紊亂程度減輕，黏膜下嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少（＜0.01），間質(zhì)增生及水腫有一定改善。見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠鼻黏膜組織形態(tài)（HE染色，×400）

圖3 各組小鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目比較（±s，每組4只）

4.4 益氣溫陽方對(duì)模型小鼠鼻黏膜組織活性氧水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織ROS水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，益氣溫陽方組和氯雷他定組小鼠鼻黏膜組織ROS水平明顯降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠鼻黏膜組織ROS水平比較（±s，105 U/mg）

4.5 益氣溫陽方對(duì)模型小鼠鼻黏膜組織線粒體形態(tài)的影響

透射電鏡觀察顯示，空白組小鼠鼻黏膜組織可見長(zhǎng)管狀線粒體廣泛分布，橢圓狀線粒體并存，線粒體嵴與雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，周圍可見高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等環(huán)繞；模型組小鼠鼻黏膜組織線粒體多呈圓球狀，線粒體嵴和雙層膜結(jié)構(gòu)模糊，線粒體長(zhǎng)度較空白組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；益氣溫陽方組和氯雷他定組小鼠鼻黏膜組織線粒體形態(tài)有所恢復(fù)，線粒體長(zhǎng)度較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見圖4、表3。

圖4 各組小鼠鼻黏膜組織超微結(jié)構(gòu)（透射電鏡，×15 000）

表3 各組小鼠鼻黏膜組織線粒體長(zhǎng)度比較（±s，μm）

5 討論

益氣溫陽方以黃芪、黨參為君，伍以干姜、桂枝、地龍、烏梅諸品，共奏補(bǔ)肺益脾、溫陽散寒之功。該方對(duì)AR臨床癥狀及局部變應(yīng)性炎癥具有良好作用。本研究顯示，造模第21日，AR小鼠即表現(xiàn)出一定的搔鼻、噴嚏現(xiàn)象，其次數(shù)隨致敏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加；益氣溫陽方組小鼠造模第23、27日搔鼻、噴嚏次數(shù)均明顯低于模型組，且隨著致敏時(shí)間延長(zhǎng)，益氣溫陽方組小鼠搔鼻、噴嚏次數(shù)趨于平穩(wěn)，與氯雷他定組比較無明顯差異，提示益氣溫陽方能在持續(xù)過敏原刺激下穩(wěn)定模型小鼠鼻腔過敏癥狀。HE染色發(fā)現(xiàn)，OVA致敏后，模型組小鼠鼻黏膜較空白組顯著增厚，黏膜纖毛倒伏，黏膜下層存在大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張，腺體排列紊亂。益氣溫陽方干預(yù)能顯著減少黏膜下層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕血管、腺體結(jié)構(gòu)改變，一定程度上緩解免疫細(xì)胞浸潤(rùn)所致黏膜增厚現(xiàn)象。另外，ELISA結(jié)果顯示，益氣溫陽方能有效逆轉(zhuǎn)OVA所致小鼠血清Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5水平升高及Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平降低。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)益氣溫陽方良好的抗過敏作用。

線粒體是細(xì)胞呼吸和代謝的能量中心。研究表明，線粒體功能紊亂及形態(tài)異常變化為T細(xì)胞異常活化、肥大細(xì)胞脫顆粒、B細(xì)胞IgE分泌等活動(dòng)的重要內(nèi)在因素。本研究結(jié)果顯示，空白組小鼠鼻黏膜長(zhǎng)管狀線粒體廣泛分布，并見散在分布的橢圓狀線粒體；模型組小鼠鼻黏膜可見大量圓球狀線粒體分布，線粒體脊、雙層膜結(jié)構(gòu)較為模糊；益氣溫陽方組和氯雷他定組小鼠線粒體形態(tài)有所恢復(fù)，線粒體長(zhǎng)度較模型組顯著增加，線粒體結(jié)構(gòu)紊亂得到改善。線粒體過度分裂導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)軗p，氧自由基代謝途徑破壞，進(jìn)而誘發(fā)線粒體釋放大量ROS。ROS能通過激活變應(yīng)性炎癥相關(guān)信號(hào)分子介導(dǎo)炎癥因子的大量釋放，加劇局部炎癥反應(yīng)。DCFH-DA染色顯示，模型組小鼠鼻黏膜組織ROS水平較空白組顯著升高，益氣溫陽方干預(yù)可降低ROS水平，其作用與氯雷他定相當(dāng)。上述結(jié)果表明，益氣溫陽方干預(yù)AR的作用可能與調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)態(tài)變化及ROS內(nèi)生相關(guān)。

本研究尚存在一定不足：①AR制備模型方案較多，各模型具備自身優(yōu)勢(shì)，但均與AR患者的臨床表現(xiàn)及病理變化存在一定差異。本研究未能采取多種模型揭示益氣溫陽方效應(yīng)及機(jī)理，所獲結(jié)論可能與該方的臨床效果存在偏差。②超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、過氧化氫酶是氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的重要指標(biāo)，受樣本量影響，本研究未對(duì)其進(jìn)行全面檢測(cè)。基于益氣溫陽方潛在的抗氧化應(yīng)激作用，今后將繼續(xù)深入探索其干預(yù)AR的具體作用機(jī)制，進(jìn)一步篩選益氣溫陽方潛在有效成分，以更好地精簡(jiǎn)、把控處方，確保其臨床療效。

綜上，線粒體動(dòng)態(tài)失衡為變應(yīng)性疾病發(fā)展的重要因素，調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)變化可能是AR治療的新方向。益氣溫陽方能有效改善AR小鼠過敏癥狀及變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，該效應(yīng)可能與抑制線粒體過度分裂及下游ROS大量釋放相關(guān)。