一種調控干細胞分化的光響應智能生物材料的制備

于釗江，趙春雪

（安陽師范學院1.化學化工學院；2.數學與統計學院，河南 安陽 455000）

干細胞因具有高度的自我復制、增值和多向分化的潛能而備受關注［1］。大量的體外實驗結果表明，在生長因子、趨化因子等生物大分子或力學因素作用下，體外培養的干細胞具有向某個方向特定分化的潛能。近年來，力學微環境被認為是一種強有力的影響干細胞分化的物理因素，引起越來越多的關注。

基于力學微環境對干細胞分化的影響，大量體外調控干細胞分化的生物材料被成功制備。如SAHA 等［2］制備了一種含有不同硬度表面精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸多肽（RGD）序列的互穿聚合物網絡，不同的基底硬度影響黏著斑的生長和延伸，從而調控干細胞的分化；文獻報道，KILIAN等［3］、MCBEATH 等［4］、KURPINSKI 等［5］設計了圓形、方形、星形、條紋、網格、微槽、微樁等多種微圖案表面，利用微圖案表面調控干細胞的分化；另外，研究者選擇利用外部設備通過一定的應力類型和加載方式對不同基底材料進行機械循環拉伸，進而調控干細胞的分化，如雙軸拉伸［6］、單軸拉伸［7］、單軸壓縮［8］等。但是，機械拉伸模式存在價格昂貴、操作繁瑣、可重復性差等問題，越來越多的研究者將目光轉向刺激響應性智能材料的設計，如KIZILKAN 等［9］利用偶氮苯類液晶彈性體的光敏特性，成功制備了一種光刺激響應的復合材料；DEFOREST 等［10］利用兩個離子正交光化學實現了生物活性全長蛋白的可逆固定化，實現了人間充質干細胞的可逆分化調控；FUHRER 等［11］合成了一種軟性磁性水凝膠，通過磁場控制水凝膠的循環變形，誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化；LIM 等［12］制備了一種電響應水凝膠多功能基質，可以通過水凝膠交聯密度和電勢梯度調節可逆調節水凝膠的各向異性彎曲。基于此，本文將單壁碳納米管（SWNTs）、聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）通過光交聯的方式制備雙層水凝膠，基于光熱能量轉換機理，對雙層水凝膠進行可逆形變調控，從而制備一中新型可用于智能調控干細胞分化的生物材料。

1 材料和儀器

主要材料和儀器：SWNTs，高純，上海巷田納米材料有限公司；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（BisAA）、過二硫酸銨（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、二苯甲酮功能化KGYSGRGDSPAS（BP-RGD），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；近紅外激光光源，功率最大5 W，中川光電。

2 實驗方法

2.1 SWNTs-PNIPAM 水凝膠制備

①羧基化SWNTs 處理。未修飾的SWNTs 在2.6 mol/L 的硝酸中回流45 h，然后酸純化的SWNTs在35～40°C 的硫酸和硝酸混合液（H2SO4/HNO3，3∶1，98%和70%）中處理24 h，引入羧基。②重結晶NIPAM。取5 g NIPAM 溶解于60℃的8 mL 甲苯中，再加入20 mL 正己烷重結晶。重復上面步驟兩次，放入真空干燥箱中干燥，然后密封放4℃的冰箱內保存。③NIPAM（791 mg,7 mmol），BisAA（5.47 mg,0.035 mmol），TEMED（7.7 mg,10 μL），羧基化SWNTs（4.3 mg）溶于10 mL 水中。④液面下通氮氣并攪拌60 min 除去水中殘余氧氣。然后將4.0 mg APS，即重量百分比20%（20 wt%）水溶液20 μL 加入到溶液中。⑤迅速倒入自制的模具中（體積為2 cm×1 cm×0.2 cm），室溫下，紫外照射24 h，使完全聚合。模具由2 個載玻片和橡膠墊圈制作。⑥制備好的水凝膠浸泡在透析袋（3 500 mm）中，在去離子水中浸泡并攪拌5 h，除去未反應完的單體和其他雜質。

2.2 SWNTs-PNIPAM 雙層水凝膠制備

①將NIPAM 單體、引發劑和交聯劑混合液，迅速倒入模具中SWNTs-PNIPAM 水凝膠層上表面，用蓋玻片使厚度達到2 mm；然后，室溫下紫外照射24 h，使完全聚合。②將制備好的雙層水凝膠浸泡在去離子水中，除去殘余物質。

2.3 RGD 化水凝膠

①一定濃度（1 mg/mL）的BP-RGD 均勻滴在載玻片上，無SWNTs 層水凝膠向下，輕放到載玻片上。②從載玻片底面紫外（365 nm）照射30 min，使其充分聚合。③制備完成的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 雙層水凝膠在PBS 中清洗2 h，除去未反應的BP-RGD。

2.4 光照實驗

2.4.1 SWNTs 吸光性實驗 室溫下，將1.5 mg/mL SWNTs 放置在試管中，用波長為808 nm 的近紅外激光均勻照射SWNTs 水溶液，水凝膠與光源距離為30 cm，光源功率為1 W，間隔3 min 測量樣品溫度。對照組為水溶液。

2.4.2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光敏實驗 室溫下，將SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠放置在載玻片上，用近紅外激光照射水凝膠，測量在照射0、15、30 min 時水凝膠體積，然后將水凝膠放置在冷水中15 min 并測量體積。對照組為無近紅外激光照射的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠。

2.4.3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激可逆形變實驗 室溫下，將SWNTs/PNIPAMPNIPAM/RGD 水凝膠放置在載玻片上，用近紅外激光照射水凝膠，測量在照射30 min 時水凝膠體積，然后將水凝膠放置在冷水中15 min 并測量體積，重復10 次。對照組為無近紅外激光照射的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠。

3 結果

3.1 SWNTs 光熱能量轉換分析

本文使用的PNIPAM 是一種典型的溫敏性水凝膠，在低溫條件下，PNIPAM 在水中具有較高的溶脹度，體積增大；當溫度升高，超過其相轉變溫度時，PNIPAM 水凝膠溶脹度降低，體積收縮。從圖1 中可以看到，SWNTs 吸收近紅外光的能量，轉換成熱量，使溶液的溫度隨光照射時間的增加而升高，15 min 時達到39℃，之后變化不明顯。從圖中可以明顯的看到，SWNTs 吸收近紅外光的能量可以達到水凝膠的相轉變溫度，實現水凝膠的形變。

圖1 不同近紅外光照時間下SWNTs 水溶液的溫度曲線

3.2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光敏性分析

通過圖2 可以發現復合水凝膠在近紅外激光的照射下，隨時間的延長，體積發生了明顯的變化，在30 min 時水凝膠體積減小近20%；之后將變形水凝膠放入冷水中15 min，水凝膠體積恢復。這是因為當近紅外激光照射水雙層凝膠時，SWNTs 吸收了近紅外光的能量，進行光熱轉換，使水凝膠溫度超過了其相變溫度，導致含SWNTs層水凝膠發生相體積的變化，從而使雙層水凝膠發生體積變化；當形變水凝膠放入冷水時，水凝膠溫度低于其相變溫度，變形水凝膠溶脹度增加，恢復形狀。

圖2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激響應曲線

3.3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激可逆性分析

根據光熱能量轉換和溫敏性水凝膠相體積轉變機理，在近紅外光均勻照射在碳納米管層水凝膠時，溫度升高，使水凝膠超過其相變溫度，使碳納米管層水凝膠產生內應力，產生形變，隨后僅使用冷水即可恢復形狀。通過圖3 可知，進行10 次循環后，雙層水凝膠體積的變化和恢復效果依然良好。

圖3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激可逆曲線

4 結論

利用光熱轉換的基本原理，成功制備了一種光刺激響應型雙層水凝膠，一層為SWNTs 水凝膠，一層為表面修飾RGD 水凝膠。通過碳納米管層水凝膠對近紅外光的吸收，實現了溫度在雙層水凝膠之間不均勻分布，進而誘發形變。在該試驗中，材料的形變僅通過冷水就可恢復到原始狀態。因此，可以通過調節SWNTs 的濃度和光強度實現對水凝膠的不同頻率、不同變形程度的調控，進而控制用于培養干細胞的RGD 水凝膠層，實現對干細胞分化的體外調控，最終實現將攜帶已分化的干細胞水凝膠層用于皮膚、軟骨、肌肉等組織的修復。